摘要：分子医药农业是利用转基因植物为载体，以农业生产的方式规模化生产各种有治疗用途的重组蛋白质及多肽。近2 0年来，随着植物生物反应器技术的多元化发展以及日趋成熟，植物分子医药农业产业悄然而生。近几年，一些分子医药农业生产的植物源医药产品已实现规模化生产，并进入市场。文中结合国内外最新的研究进展，重点对几种主要植物生物反应器的研究、产品的规模化生产以及产业化进程进行了阐述，以期为我国分子医药农业领域的研究与应用提供参考。

    关键词：分子医药农业；植物生物反应器；植物源医药产品

    分子医药农业(m o l e c u l a r p h a r m i n g或b i o p h a n n i n g)是利用转基因植物以农业规模来生产人类所需的医药蛋白质¨J。这是一项融合农业、生物技术和医药为一体的高新技术，无疑将会对传统的医药生产体系产生革命性的影响，为人类提供廉价、安全和充足的医药产品。分子医药农业的核心内容是重组蛋白的表达技术，即生物反应器技术，随着植物生物反应器外源蛋白表达水平的提高和纯化加工技术的配套，该技术在许多发达国家已经由研究阶段转入应用阶段。研究证明，各种抗体、口服疫苗、抗肿瘤药物(包括蛋白酶抑制剂、多肽)以及一些高营养价值的蛋白质均可以通过分子医药农业方式进行生产J。本文简述了几种主要植物生物反应器的研究进展，并对国外分子医药农业的规模化及产业化生产现状及发展趋势作了简单介绍。

1植物生物反应器的研究进展

    植物生物反应器是指利用植物细胞做“生产车间”来生产具有商业和医用价值的生物制品，包括疫苗、抗体、药用蛋白等。根据目的蛋白表达和储藏的器官可归纳为三大类，即以全部植株或叶片作为生物反应器，称为生物总量表达体系(叶绿体表达体系也属于此列，但有其独特之处，将分开阐述)；以悬浮细胞培养为主的生物反应器和以种子或果实为重组蛋白表达和储藏器官的生物反应器。下面将对各个表达体系的研究进展和优缺点作简要介绍。

1．1生物总量(B i o ma s s)表达体系

生物总量表达体系又可分为瞬时和稳定表达两大类。瞬时表达体系是利用植物病毒为载体使药用蛋白随病毒在植物细胞内复制、装配而高效表达3 J。M a r i l l o n n e t等对烟草花叶病毒(T M V)表达载体进行了改进，发展了“M a g n i f e c t i o n”技术体系，结合农杆菌浸染与病毒快速繁殖传播的优势，提高了多个物种中外源蛋白的表达水平J。同时，表达载体的载量也有很大的突破：最初只能用于表达少于2 5个氨基酸的小肽，目前可以插入2．3 k b的片段，表达大约为8 0 k D的重组蛋白。此外，通过共浸染两种非竞争性的载体来同时表达抗体的重链与轻链，可以用于生产完整的抗体，产量约为0．5 g／k g。稳定表达体系是将目的蛋白基因整合到植物的核基因组中，采用组成性启动子(如U b i和C a M V 3 5 S启动子)使重组蛋白在整个植株中进行组成性表达。由于缺乏稳定的内环境，外源蛋白在细胞质中容易降解，表达水平一直较低，约占可溶性总蛋白量(T S P)的0．5％一2．0％；随后采用内质网的滞留信号来克服这个问题，不仅表达水平有所提高，还避免了重组蛋白进入高尔基体，产生植物特有的糖基化修饰J。就整体而言，表达水平一直是生物总量表达体系的瓶颈，同时下游加工与贮藏也受到时空限制。但瞬时表达体系能在短期内获得克级量的蛋白，可以及时提供研究所需的材料，获得关于重组蛋白表达以及功能性研究的一些数据。

1．2叶绿体表达体系

    叶绿体表达体系以其高表达、易纯化、多基因同时表达、环境安全性高等优势吸引了许多科学家的关注。近年来，在叶绿体(叶片)及非绿色质体(胡萝卜、西红柿)中成功表达的疫苗抗原包括霍乱病毒蛋白B抗原(4％T S P)、破伤风病毒抗原(2 5％T S P)和狂犬病毒抗原(3 1．1％T S P)等；许多药用蛋白如干扰素(6％T S P)、人生长激素(7％T S P)、人血清白蛋白(1 1％T S P)、抗菌肽(2 1．5％～4 3％T S P)等也在该体系中得到表达J。可是当重组蛋白表达水平高时，蛋白容易聚集形成类似于细菌“包涵体”的物质，虽然纯化时无须成本昂贵的层析柱，但是这些不溶的蛋白往往失去了活性(如人血清白蛋白)，一定程度上局限了该体系的应用。经实验证明，叶绿体还有简单的翻译后修饰功能：G l e n z K等在转基因烟草叶绿体中表达的伯氏疏螺旋体的外表脂蛋白A(O s p A)，动物实验表明该重组蛋白有N．端的脂化修饰，从而可以使老鼠产生足够的抗体抵御伯氏疏螺旋体病菌。但是目前功能涉及糖基的糖蛋白仍不适合用叶绿体转基因植株进行生产。

1．3悬浮细胞培养体系

    在植物转基因悬浮细胞中表达外源蛋白，整个生产流程都可以受到严格监控，因此有利于通过国家G M P(g o o d m a n u f a c t u r i n g p r a c t i c e)认证，并且消除公众对“基因污染”的忧虑。目前最常用的是烟草的B Y．2和N T．1细胞系，其它体系还有大豆、番茄和水稻等植物的悬浮细胞系。据报道，3 0余种重组蛋白已成功表达，包括抗体、白介素、促红细胞生成素、集落刺激细胞生长因子、乙肝抗原等。但低表达水平(一般<1 0 m g／L)和不易规模化生产是这个体系的制约性因素，而且悬浮细胞易聚集成团，蛋白产量会随着时问的推移而下降J。类似的表达体系还包括根系分泌系统¨、苔藓生物反应器_1、水生植物反应器(衣藻、浮萍)等，共同的特点是都在无菌的容器中悬浮或漂浮生长，易于管理与质量控制。

1．4果实／蔬菜表达系统

    果实／蔬菜表达体系适合生产口服疫苗，食物添加剂和抗体，因为直接食用或经粗略加工即可，避免破坏蛋白质活性，从而节省昂贵的蛋白纯化成本。在马铃薯中表达重组蛋白的研究比较多，但明显的局限因子是直接食用容易引起食物中毒，而加热去除毒素的过程会导致许多非耐热性疫苗失效。近年来人们关注一些可以生食的表达宿主，如香蕉和番茄等。例如，在番茄中表达狂犬疫苗，虽然表达水平不高(<3 g)，但作为一种高产且安全食用的大棚蔬菜，仍不失为一个可行的体系，并且可以加工成千粉以胶囊的形式服用。总体而言，果实／蔬菜表达体系在表达口服疫苗中有独特的优势，不过在实际应用中，还存在剂量难控制等问题¨。

1．5种子表达体系

    基于表达水平高、生产成本低以及加工便利等显著优势，种子表达体系是目前规模化生产较为成熟的表达体系。种子能够提供一个相对稳定的内环境，使重组蛋白表达积累到一个较高水平，如V e n—t r i a B i o s c i e n c e公司利用水稻胚乳生产重组溶菌酶及重组铁乳蛋白，表达量分别为6 g／k g和5 g／k g，占可溶性总蛋白的4 5％和2 5％_1；同时，种子是最佳的“天然容器”，重组蛋白在常温下储藏2～3年而不丧失生物活性，并且由于重组蛋白贮藏在一个很小的空问，产品运输十分便利。这些优势不仅有利于选择合适的地点种植转基因植株，还可以根据市场需求灵活地进行下游加工_1；此外，油料作物在重组蛋白的纯化中有独特的优势，S e m B i o S y s公司凭借油体蛋白．重组蛋白融合技术，使外源蛋白定位于油体表面，通过回收上层油相即可很方便地将融合蛋白与细胞其他组分分开，从而大大降低了纯化的成本。

    目前常用的宿主有谷类作物、豆类作物及油料作物，由于公众存在着对转基因植物安全的一些疑虑，因此选用种子表达体系时，要优先考虑自花传粉的作物。相对于玉米、油菜等异花传粉的植物，豌豆、大麦、水稻、红花等严格自交的作物是更为理想的表达宿主。

     综上所述，近年来植物生物反应器的迅猛发展为分子医药农业提供了多样化的生产平台，许多重组蛋白都在植物体系中得以表达，特别是一些与全球人类健康关系紧密的蛋白在各种表达体系中尝试着表达，如人血清白蛋白，乙肝病毒疫苗，H I V．1疫苗等。在发达国家，许多生物公司基于自主研发的表达平台，引领分子医药农业的产业化进程(表1)。I c o n G e n e t i c s公司基于M a g n i f e c t i o n的技术平台，在烟草中用烟草花叶病毒和马铃薯x病毒载体高效表达出完整的单克隆抗体，同时该公司还拥有核稳定转化和质体转化相关的十几项专利¨。根据瞬时表达体系快速的特点，M e d i c a g o公司致力于流行感冒疫苗的研发与生产，应对突发性、来势凶猛及范围广的流行性疾病。G r e e n o v a t i o n公司利用苔藓生物反应器生产“人源化抗体”的优势，努力开拓用于治疗肿瘤的抗体市场。N o v o p l a n t公司于2 0 0 7年9月完成了田问试验，证明转基因饲料豌豆(直接喂养牲畜)可以稳定表达肠毒素大肠杆菌抗体，是一个生物安全性高、无环境污染且成本低的生产体系。V e n t r i a B i o s c i e n c e公司利用转基因水稻批量生产重组人溶菌酶和人铁乳蛋白(纯度在9 5％以上)，生产成本约为每克5．9美元，已进入培养基和检测试剂市场¨5 1 J。S e m B i o S y s公司在油料作物中生产一系列医药蛋白，如胰岛素和一些用于治疗心血管疾病的重组蛋白，分别在2 0 0 7、2 0 0 8年进入临床试验阶段，预计胰岛素将在2 0 0 9或2 0 1 0年上市，成为第一批供人类使用的植物源医药产品之一。[22]

2产品加工及市场

2．1重组蛋白下游加工与纯化

    医药蛋白约8 0％的生产成本来源于下游的加工与纯化，与微生物及动物体系生产的重组蛋白相比，植物源医药产品有明显的成本优势：重组蛋白在大肠杆菌等原核生物中表达水平很高，但往往以不可溶、无生物活性的包涵体形成存在，操作复杂的蛋白复性造成了高额的生产成本，而且对于内毒素和病菌的去除及检测开销巨大；而在动物及动物细胞系中生产重组蛋白，除去动物蛋白以及对于病原体的控制都需要高额成本¨。

    此外，一些植物表达体系本身就具有独特的成本优势，如口服疫苗无须高昂的纯化成本。S e m b i o—s y s公司结合油体蛋白一重组蛋白融合技术以及种子表达体系易规模化的优势大幅度降低了纯化及生产费用。2 0 0 7年1月，公司成本估算显示，S e m b i o s y s公司相对于现存的重组胰岛素生产体系节省了约7 0％的生产成本，降低至少4 0％的产品成本(h t t p：／／W W W．i n-p h a r m a t e c h n o l o g i s t．c o r n／n e w s)。许多研究机构及生物公司纷纷投入大量资金用于研发便利且经济的纯化工艺。V e n t r i a B i o s c i e n c e公司通过对各种缓冲液的优化，仅经过一步离子交换层析就得到纯度高(约为9 5％)、有活性的重组铁乳蛋白。本实验室在水稻胚乳中高水平表达了重组人血清白蛋白(r H S A)，经两步离子交换层析，即可得到纯度>9 6％的蛋白样品，与市售S i g m a(9 6％～9 9％)的人血清白蛋白纯度相当；结构分析表明r H S A的二级和高级结构与天然H S A类似，而且细胞活性实验显示r H S A保持了天然活性(未发表数据)；r H S A的安全性、毒理、药效及药物代谢等相关研究正在进行之中。

2．2分子医药农业商业化现状

    目前，至少有十余种植物源重组蛋白进入了培养基和检测试剂市场，如S i g m a公司销售的铁乳蛋白、胰蛋白酶、亲和素等，而且约半数的公司都有产品进入临床试验(见表2)(h t t p：／／w w w．m o l e c u l a r．f a r m i n g．c o m／P M P s—a n d—P M I P s．h t m 1)。虽然迄今为止还没有一个供人类使用的植物源医药产品通过F D A审批并成功上市，但是2 0 0 6年1月，D o w A g r o．S c i e n c e s公司生产的新城病疫苗得到了美国农业部兽类疫苗中心批准，是兽类及人类植物源医药产品发展史上的里程碑。目前，各大生物公司都加快了规模化生产的步伐，积极推动供人类使用的植物源医药产品上市。据2 0 0 7年3月2日的华盛顿邮报报道，V e n t r i a B i o s c i e n c e公司于2 0 0 6年8月获准在堪萨斯州发展3 2 0 0英亩(约1 2 9 5 h m)转基因水稻基地，并于2 0 0 7年春季种植4 5 0英亩(约1 8 2 h m)。预计近几年，将有数种植物源医药蛋白(P M P)上市，而且这一趋势将在本世纪迅猛发展。

3植物源医药产品的糖基化问题及解决方案

    目前许多P M P s都已经得到成功的表达及纯化，如炭疽保护性抗原、S I g A(C a r o R x)、脂肪酶、人类内因子等j，并且经过动物实验(部分通过了临床试验)证明这些重组蛋白的有效性。但是P M P s与天然蛋白在糖基化修饰上存在着一些差异，如植物中有O L一1，3．岩藻糖及B一1，2一木糖修饰；在哺乳动物中则是仅一1，6一岩藻糖修饰，并且没有木糖残基。临床试验表明，局部应用含有植物复杂糖基化修饰的P M P s不会对病人产生任何副作用拍，但是避免植物特有的糖基化修饰，并通过生物工程技术生产“人源化”蛋白将有利于扩大P M P s产品的使用范畴，成为了当前分子医药农业领域的研究热点之一，主要有如下几种策略。

    (1)利用内质网滞留信号(K／H E D L)来避免植物特有的糖基化修饰。糖基化修饰发生在内质网及高尔基体中，初级的修饰主要在内质网中，而较为复杂的修饰则在高尔基体进行。因此早在1 9 9 6年就有学者尝试着通过在目标蛋白的N／C．末端添加内质网滞留信号(K／H E D L)，使重组蛋白滞留在内质网中，避免其进入高尔基体发生复杂的糖基化修饰J。S r i r a m a n等也借助K／H E D L信号，在转基因烟草中成功地表达了无免疫原性、无植物特有糖基化修饰的高甘露糖型抗体，不过与正常糖基化的抗体相比，半衰期很短。但是这种半衰期短的N．高甘露糖型植物源抗体(m A b)在被动免疫治疗中可以转变成一种优势：由于m A b在循环系统中存在时间短，因此可以避免干涉机体的主动免疫。N．高甘露糖型P M P的另一个优势在于可以与巨噬细胞或树突状细胞的甘露糖特异性受体相互作用，这对于某些医药蛋白靶向到巨噬细胞从而发挥药效是必须的，如治疗高歇病的葡糖脑苷脂酶(G C D)——目前最昂贵的医药蛋白(每个患者平均一年要花5 0万美元)。在C H O中生产重组人类葡糖脑苷脂酶(r h G C D)需要在体外用一系列糖苷酶进行消化从而将r h G C D的甘露糖残基暴露出来。但是在植物表达体系中，利用E R定位信号便可以直接生产出适合高歇病酶替代疗法的r h G C D；类似的策略还有：使用拟南芥的复杂糖基化缺失突变株来表达不含植物复杂糖基化修饰的高甘露糖型r h G C D_3。

    (2)通过植物的糖基化工程来生产“人源化”的P M P s。利用R N A干涉或基因敲除技术，在苜蓿、浮萍以及苔藓¨中都成功地建立了无植物特有的糖基转移酶基因的转基因株系。其中，苔藓生物反应器在这个方面尤为领先：在“双敲除”的植株中，已成功将人类特有的半乳糖基转移酶基因插入木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶基因的敲除位点，使得糖基化修饰机制更加接近人类。有证据表明，在糖基化工程修饰的转基因系中表达的单克隆抗体有显著增强(>4 0倍)的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(A D C C)，大幅度提高了植物源抗体的产品质量J。

进一步的研究方向是生产含有末端B一1，4一半乳糖和唾液酸残基的P M P s，对于提高药物质量将有显著的帮助。近年来的一些工作表明，这些复杂的生物合成过程在植物中都可以进行重建，如哺乳动物的0【-2，6一唾液酸转移酶、人类的C M P．N．乙酰神经氨酸合成酶、C M P一唾液酸转运蛋白、两个有催化活性的微生物N．乙酰神经氨酸合成酶以及拟南芥的B．1，2．木糖转移酶的高尔基定位信号与人类B．1，4一半乳糖转移酶的催化区域的融合蛋白都成功地引入到植物中并发挥其相应的功能。

与上述在N．糖基化方面所做的工作相比，目前对于P M P s的0一糖基化报道很少，只有K a r n o u p工作小组分析了在转基因玉米中表达的一个重组人类I g A 1(p I g a 1)的0一糖基化。关于0．糖基化差异对P M P s产品质量的影响还有待更多深入的研究。在P M P s产品开发中，更多是需要实验数据来验证这些N．及0一糖基化修饰差异带来的正面或负面的影响。如P r o t a l i x公司通过添加一个特殊的C-端分选信号将r h G C D定位于贮藏性囊泡中，据推测囊泡中的某些酶使得r h G C D维持末端甘露糖的糖基侧链。但是对该产品进行糖基结构分析也含有植物特有的．1，3一岩藻糖及B一1，2一木糖修饰。而I期临床试验结果表明，静脉注射不同剂量的植物源r h—G C D，无免疫原性、病人耐受性好而且无不良反应报告，与C H O中生产的同类产品C e r e z y m e相比具有成本低、半衰期长、药效更持久的优势。有可能是因为r h G C D借助甘露糖残基与巨噬细胞的相互识别作用从而避免了与其它血液成分起免疫反应，但是具体的原因尚没有相关的更深入的研究。

4展望

    国际上分子医药农业研究在其核心技术植物生物反应器、后期纯化工艺，以及商业化运作模式等方面已取得了较大突破，有些产品生产已初具规模，预计短期内将有较快发展和可观的市场份额。在我国发展分子医药农业产业，可以说机遇与挑战并存，机遇是分子医药农业在国际上处于发展初期，基于我国丰富的科技人才资源、巨大市场需求等优势，这个领域是赶超世界先进水平的最好领域之一；同时要看到还面临着知识产权的挑战，但是只要我国科学家在吸收国外先进技术的同时，立足于自主创新，完全可以突破知识产权的瓶颈。因此，遵循高效、经济的原则，选用表达水平高且易规模化的体系，最大程度上利用我国现有的优势，在短期内加速发展分子医药农业是完全可能的。发展分子医药农业产业不仅具有巨大的市场前景，可为我国l 3亿人民提供安全、廉价和充足的医药产品，还可抢占分子医药农业

技术的制高点，对于提高我国在医药市场上的竞争能力具有十分重要的战略意义。