摘要以H E K 2 9 3细胞为模型，利用R N A干扰技术，将神经鞘磷脂合成酶(S M S)的同工酶(S M S 1和S M S 2)的s i R N A分别联合、转染H E K 2 9 3细胞．通过薄层层析法评价S M S酶活性，同时测神经酰胺(C e r)、卵磷脂(P C)及神经鞘磷脂(S M)的水平，并以流式细胞仪和A n n e x i n V-F I T C、P I双染法检测细胞凋亡．结果显示，与对照组相比，S M S基因沉默后S M S表达水平降低(分别降低1 7％，2 0％，4 9％)；S M水平显著性降低(P<0．0 5)；C e r水平显著性升高(P<0．0 5)；T N F—诱导的凋亡显著性升高[分别为5 8％(P<0．0 1)，2 4％(P<0．0 5)，7 7％(P<0．0 1)]．这些结果提示，S M S基因沉默能降低S M水平并升高C e r水平，明显增加T N F—O／诱导的H E K 2 9 3细胞凋亡．由于S M是动脉粥样硬化形成的独立危险因子，因此本研究有可能为动脉粥样硬化的治疗找到新的靶点和有效途径．

    关键词 神经鞘磷脂合成酶；薄层层析；神经酰胺；神经鞘磷脂；细胞凋亡

    R N A干扰(R N A i n t e r f e r e n c e，R N A i)是一种高效、高特异性及敏捷的基因沉默技术，是功能基因组研究的有效工具．神经鞘磷脂合成酶(S p h i n g o m y e l i n s y n t h a s e，S M S)是神经鞘磷脂(S p h i n g o m y e l i n，S M)合成途径中的最后一个酶，催化神经酰胺(C e r a m i d e，C e r)和卵磷脂(P h o s p h a t i d y l c h o l i n e，P C)生成S M和甘油二酯(D i a c y l g l y c e r o l，D A G)．S M S有S M S 1和S M S 2两个同工酶．S M S 1定位于顺面高尔基体，S M S 2定位于细胞膜…．S M S活性改变将影响细胞内S M，C e r，D A G和P C的浓度，进而引起细胞功能的改变．

    最近，关于S M S活性与细胞凋亡的关系存在争议．有报道认为，低调S M S能降低羟基溶血磷脂诱导的凋亡；也有报道认为，S M S高表达促进C H O细胞中肿瘤坏死因子(T u m o r n e c r o s i s f a c t o r—a l p h a，T N F一)介导的凋亡，S M S基因沉默抑制了脂多糖介导的T H P一1细胞凋亡3；另外，S M S 1高表达抑制由光损伤介导的凋亡_4 J．为了进一步证明S M S活性与细胞凋亡的关系，本课题以H E K 2 9 3细胞为研究模型，在T N F—诱导凋亡的情况下，分别用S M S 1 s i R N A，S M S 2 s i R N A，对照s i R N A及S M S 1 s i R N A和S M S 2 s i R N A联合转染H E K 2 9 3细胞，研究S M S基因沉默与凋亡之间的关系．

1实验部分

1．1试剂与仪器

N B D．S M为M o l e c u l a r p r o b e s公司产品；N一乙基一Ⅳ一(2一羟基3．磺丙基)-3，5一二甲氧基苯胺钠盐(D A O S)为D o j i n d o M o l e c u l a r T e c h n o l o g i e s公司产品；N B D—C e r a m i d e，P h o s p h a t i d y l c h o l i n，C h o l i n e o x i—d a s e，P e r o x i d a s e，S p h i n g o m y e l i n，S p h i n g 0 m y e l i n a s e及P C-P h o s p h o l i p a s e D均为S i g m a公司产品；L i p o—f e c t a mi n e T M 2 0 0 0，O P T I．M E M@和M i n i m u m E s s e n t i a l M e d i u m(M E M)培养基为I n v i t r o g e n公司产品；T N F．为第二军医大学常州药业股份有限公司产品；A n n e x i n V．F I T C凋亡试剂盒为C a l b i o c h e m公司产品；其它均为国产分析纯试剂；S M S 1 s i R N A和S M S 2 s i R N A为美国纽约州立大学下州医学中心蒋宪成教授惠赠；H E K 2 9 3细胞由中国医学科学院基础医学细胞中心提供．

    层析板为W h a t m a n公司产品；2 4孔板为C o m i n g公司产品；M u h i s k a n A s c e n t酶联检测仪(T h e r m oF o r m a公司)；A／B 3生物安全柜(T h e r m o F o r m a公司)；D U 6 4 0核酸蛋白分析仪(B e c k m a n公司)；T S 1 0 0倒置显微镜(N i k o n公司)；H E R A C E L L二氧化碳培养箱(德国)；I S一2 2 0 0凝胶图像分析系统(A l p h a公司)；F A C S C a l i b u r流式细胞仪(美国B D公司)．

1．2实验过程

1.2.1细胞培养将H E K 2 9 3细胞置于含1 0％胎牛血清和8 0 I U／m L硫酸庆大霉素的M E M培养基中，在3 7 o C，5％C O，饱和湿度的条件下培养．当细胞生长接近9 0％融合时消化传代．收集处于对数生长期的H E K 2 9 3细胞，分为4组：(1)对照s i R N A转染组(c o n)，(2)S M S 1 s i R N A转染组(s i R 1)，(3)S M S 2 s i R N A转染组(s i R 2)，(4)S M S 1 s i R N A和S M S 2 s i R N A联合转染组(s i R 1／s i R 2)．用L i p o—f e c t a m i n e T M将s i R N A转人H E K 2 9 3细胞，转染4 8 h后，分别测S M S酶活性及细胞S M，P C和C e r水平，并进行细胞凋亡实验．

1.2.2诱导凋亡与R N A干扰收集6 x 1 0个处于对数生长期的H E K 2 9 3细胞转种于2 4孔板中．当细胞贴壁后，将原培养基吸出，用不含牛血清和抗生素的培养基洗涤2～3次，换成此培养基，饥饿3～4 h；每孔加T N F一(2 0 0 n g／m L)诱导凋亡2 4 h．将s i R N A和L i p o f e c t a m i n e。。M 2 0 0 0加至2 4孔板中．c o n组、s i R 1组和s i R 2组转染组分别转染1 0 0 p m o l s i R N A；s i R 1／s i R 2组转染1 0 0 p m o l s i R N A(各5 0 p m o 1)．

1.2.3 S M S酶活性测定转染4 8 h后的H E K 2 9 3细胞用胰酶消化，收集细胞，于冰上匀浆，离心，取上清液，在S M S反应体系中于3 7 q c反应5 h，用氯仿／甲醇抽提有机相，氮气干燥，薄层层析法测定S M S酶活性．

1.2.4 S M，P C和C e r测定S M和P c用酶法测定：先洗涤细胞，萃取细胞脂类，然后加酶显色液孵育4 5 m i n，在5 9 5 n m处测量光吸收．C e r的含量测定J：将萃取的脂类置于含有D A G激酶的缓冲液中孵育3 0 m i n，用薄层层析法测C e r，同时作标准曲线，计算C e r的量．

1.2.5流式细胞仪分析细胞凋亡根据说明书用A n n e x i n V-F I T C和P I染色，收集各孔培养基，胰酶消化，洗涤细胞，离心收集细胞，与已收集的培养基合并．以1 0 0 0 r／m i n转速离心5 m i n弃去上清液，加入1 0 0 i L L染色液悬浮，避光室温孵育1 5 r a i n，用于流式细胞仪分析．

2结果与讨论

2．1 R N A干扰后S MS酶活性测定在酶反应体系中，由于底物(神经酰胺)分子上带有绿色荧光染料，生成的产物(S M)也带有绿色荧光，用标准品(带有绿色荧光染料的S M)作对照，T L C法测定S M S酶活性，结果如图1所示．经凝胶图像分析仪扫描，S M S 1和S M S 2基因沉默后与对照组的灰度比值：s i R 1组(0．8 3-4-0．0 2)表达水平降低1 7％，s i R 2组(0．8 0±0．0 5)表达水平降低2 0％；s i R 1／s i R 2组(0．5 1±0．0 6)表达水平降低4 9％．说明S M S 1和S M S 2基因沉默后S M S在H E K 2 9 3细胞内低表达．

2．2 R N A干扰后神经鞘磷脂、神经酰胺和卵磷脂水平测定

    S M S 1 和 S M S 2基 因沉 默 后 ， S M， P C和C e r 的浓度水平见表 1 ， 与对照组相比， S M水平显著性降低 ， C e r 水平显著性升高， P c水平无显著性改变

2．3 R N A干扰后细胞凋亡分析

   S M S 1和S M S 2基因沉默后，T N F—的诱导凋亡显著性升高(见图2)，与对照组相比，s i R 1组升高5 8％(P<0．0 1)；s i R 2组升高2 4％(P<0．0 5)；s i R 1／s i R 2组升高7 7％(P<0．0 1)．

2．4讨论

    细胞被D 6 0 9抑制显著性降低S M S活性，从而引起细胞内S M水平显著性下降；研究显示，S M S高表达对细胞和培养基S M水平有调节作用J．本实验证明，S M S基因沉默不仅降低了S M S活性，也降低了细胞S M水平(见图1和表1)．这些实验结果提示S M S与S M水平有重要关联．从理论上分析，S M是S M S催化的产物，S M S活性改变，产物S M相应改变，与实验结果相符．S M是广泛存在的哺乳动物细胞膜和脂蛋白的组成成分，是细胞膜脂筏的主要组成成分，细胞膜上的S M约有6 5％定位于细胞膜脂筏J．已知脂筏是信号传导的微细结构域，且S M S活性的降低减少了脂筏S M的量j．S M S基因沉默，降低了S M水平，而S M是动脉粥样硬化(A t h e r o s c l e r o s i s，A S)的独立危险因子，因此本研究有可能为A S的治疗找到新的靶点和有效途径．H E K 2 9 3细胞S M S基因沉默后，T N F—O／诱导的凋亡显著性升高(见图2)．实验证明了S M S基因沉默，S M S活性降低，由于C e r是S M S催化的底物，当S M S基因沉默、活性降低时，底物C e r的利用量减少，C e r量自然会升高，与实验结果一致．且C e r是已知的促进细胞凋亡的信号分子¨，在S M S活性被处理后，改变细胞C e r水平，会对细胞凋亡有影响．与已有报道不一致的原因可能在于不同的细胞的S M S活性与细胞凋亡的关系不一样，也可能存在其它的可能性．含过多的胆固醇(C h o l e s t e r o l C H)的巨噬细胞泡沫化是A S的病理特征．实际上，细胞凋亡与A S的关系是复杂的，最近报道显示¨，巨噬细胞凋亡对早期细胞膜损伤的调控可以减慢斑块的形成，1 7 6 2高等学校化学学报V 0 1．3 0然而A S晚期凋亡引起坏死性斑块生成，进而引起血栓症，可见晚期巨噬细胞凋亡可致A S．因此S M S基因沉默诱导细胞凋亡是致A S还是抗A S，是将来要解决的问题．如果将S M S活性对不同的细胞影响不同的效应恰到好处地应用于A S的治疗，有可能为A S的治疗找到新的靶点和有效途径．