摘要：利用紫外可见吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱及圆二色(c D)光谱研究了铜(Ⅱ)离子与神经红蛋白(N G B)的相互作用。结果表明，C u“离子使N G B在2 8 0 n m处的紫外吸收增强，说明C u与N G B发生了相互作用；C u“使N G B内源性荧光发生猝灭，其猝灭机制为静态猝灭；同步荧光光谱表明，C u“使色氨酸微环境的疏水性有所降低，C u对N G B的作用位点更接近于色氨酸：C D光谱显示C u没有引起N G B二级结构明显的变化。

    关键词：铜(Ⅱ)离子；神经红蛋白；紫外可见吸收光谱；

    神经红蛋白f N e u r o g l o b i n．N G B)是近期由德国科学家B u瑚e s t e r等[1】在人和鼠中发现的一种新颖的珠蛋白，它主要在脑、视网膜等神经组织中表达。人源神经红蛋白是由一条含1 5 1个氨基酸的多肽链和一个血红素b辅基构成与血红蛋白和肌红蛋白相比．其氨基酸序列的同源性虽然只有2 0％～2 5％l 2 l，但它们的空间结构却很相似[3 1神经红蛋白中的血红素F e在无外源配体存在时是六配位的。即血红素F e以4个吡咯N原子作为赤道配体、以蛋白肽链上的2个组氨酸(H i s 6 4和H i s 9 6)上的咪唑N原子作为轴向配体形成八面体结构．而血红蛋白和肌红蛋白中的血红素F e则是五配位形式新的结构必将赋予其新的性质和功能研究表明．N G B是一种低氧／缺血条件下诱导的神经组织蛋白．当脑缺血时N G B的表达量增加．N G B的高表达对神经红细胞具有保护作用．但关于N G B的确切生物学功能还不清楚因此．该蛋白的发现为生物无机化学工作者提出了新的课题．对它的化学生物学基本问题的研究有助于了解其结构与功能之间的关系．并为阐明它的生物功能提供线索

    至今．有关金属离子与N G B的相互作用未见报道铜是生物必需的微量元素之一．在生命过程中起着重要的作用特别是在神经系统中铜含量较高，铜与神经系统的正常生理功能和神经退行性疾病f如阿尔茨海默病和疯牛病)都密切相关因此．研究铜离子与在神经系统中特异性表达的神经红蛋白之间的相互作用及对它的结构的影响．不但有助于进一步了解C u 2+的生理功能．而且对N G B的基本化学生物学性质及其生物功能的探讨都具有十分重要的意义关于含血红素的生物分子与金属离子的相互作用机理有两种不同的作用方式：一是重金属离子能取代含血红素的生物分子中铁卟啉的F e(1 I)而使该分子的光谱性质发生变化[5 1：二是重金属离子与生物分子中的多肽链相互作用．改变了多肽链的构象而使其光谱性质发生变化问本实验室已进行了N G B的基因表达、分离纯化和谱学表征．并对N G B的某些化学生物学性质进行了初步研究[7 l本文运用紫外可见吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱及圆二色光谱研究了C u 2+与神经红蛋白的相互作用实验结果显示．C u：+以第二种作用方式与N G B发生反应．为了解金属离子与神经红蛋白相互作用提供了有用的实验数据和理论依据

1实验部分

1．1试剂与仪器

    神经红蛋白f本实验室制备l 7 l，电泳纯1．使用时配制成一定浓度的储备液(现配现用)；硫酸铜(分析纯)，配制成1 0 m m o l·L储备液；N a 2 H P O·1 2 H 2 O和N a H z P O·2 H O(均为分析纯)，配制成N a：H P O．N a H 2 P O缓冲溶液(0．1 m o l·L～，p H 7．0)；实验用水为去离子水H P 8 4 5 3 A型紫外可见阵列二极管分光光度计f U S A)。L S 5 5型荧光分光光度计(P e r k i n E l m e r．U S A 1，J a s c o J．8 1 0圆二色光谱仪(J a p a n)。

1．2实验方法

1．2．1紫外可见吸收光谱的测定

    取一定量N G B母液与不同试管中．用1 0 0 m m o 1．L～N a H P O 4-N a H 2 P O(p H 7．0)缓冲溶液稀释，再分别加入不同量的C u S O溶液每个试管中N G B的终浓度为5 m o 1．L～，混合均匀后，使之充分反应。以磷酸盐缓冲溶液作参比．于1 c m的石英比色皿中测定室温下不同物质的量比的C u 2+与N G B相互作用的紫外可见吸收光谱

1．2．2荧光光谱的测定

    将所配1．2．1溶液以2 8 0 n m为激发波长．于L S5 5型荧光分光光度计记录荧光发射光谱激发和发射狭缝均为1 0 n m．扫描速度3 0 0 n m．m i n～．所有光谱均扣除了其本底溶液的干扰

1．2_3同步荧光光谱的测定

    将所配1．2．1溶液．在L S 5 5型荧光分光光度计上利用同步荧光模式扫描同步荧光光谱固定激发波长和发射波长间隔△A分别为2 0和8 0／'l m．扫描速度3 0 0 n m．m i n-．激发和发射狭缝均为1 0 n m

1．2．4圆二色光谱的测定

    取一定量N G B母液与不同试管中．用1 0 m m o l·L～N a 2 H P O一N a H 2 P 0(p H 7．0)缓冲溶液稀释，再分别加入不同量的C u S O溶液每个试管中N G B的终浓度为5 L L m o卜L～，混合均匀后，使之充分反应，进行圆二色光谱测定光源系统用氮气保护f流量为5 L．m i n)．采用1 m m光径样品池．光谱扫描时均扣除溶液空白的干扰，测量参数为：扫描波长范围为1 9 0～2 5 0 n m．扫描速度为1 0 0 n I l 1．m i n-1．分辨率0．1 i q m，响应时问为1 S．狭缝宽度1 n m．累计次数为3次

2结果与讨论

2．1紫外可见吸收光谱

    一般来说氨基酸的微环境由蛋白质分子的构象决定，蛋白构象改变，微环境改变，生色基团的吸收光谱随之发生改变．因此由光谱特征的变化可获得蛋白质构象变化的信息_8 l N G B在2 8 0 n m处的吸收峰是其肽链上的色氨酸和酪氨酸的芳香环7 r．7 r跃迁引起的

    由图l可见．随着C u+浓度的增加．N G B在2 8 0 n m处的吸收强度逐渐增强2 8 0 n m处的吸收峰发生明显的增色效应．说明C u与N G B发生了相互作用．而这种作用有利于7『．7 r跃迁的发生这与文献报道C u与肌红蛋白的研究结果类似l 9 l氧化态N G B在4 1 3 i l n 3处有强吸收峰．它对应于金属卟啉的S o r e r吸收带．是电子在卟啉环中非定域化7 r电子轨道跃迁f 7 r一7 r 1的结果…】。图l所示，S o r e t带的吸光度略微减小．并且峰位没有发生移动这说明铜离子作用于N G B后对血红素环境产生轻微的影响．但是并没有替换出血红素中的铁离子这和以前报道的五配位的肌红蛋白中血红素铁可被C u 2+替换不同．表明六配位神经红蛋白的稳定性

2．2荧光光谱

    蛋白质分子产生荧光的结构基础在于它本身的f内源性)荧光基团：色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸『1 3 1。蛋白质的荧光一般是在吸收最大值的波长2 8 0 n m附近激发。因此．在多数实验条件下不能激发苯丙氨酸此外，蛋白质中的苯丙氨酸的量子产率低，实际上也很少能观察到该氨基酸的发射．大多数蛋白质的荧光主要来源于色氨酸和酪氨酸残基。在2 8 0 n m激发时．大多数天然蛋白质的荧光发射主要归于色氨酸残基的荧光或色氨酸与酪氨酸残基的共同贡献蛋白质的内源荧光变化在一定程度上可反应蛋白质中荧光生色团微环境的变化I l 5】。

    由图2可以看出．2 8 0 n m激发下，N G B的荧光最大发射峰出现在3 4 3 n m处。随着N G B溶液中C u浓度的增加．荧光最大发射峰位没有产生位移，而荧光强度逐渐降低．出现有规律的猝灭。这说明C u z+与N G B分子存在相互作用．发生了能量转移．且C u作用使荧光生色团的微环境发生改变。也就是说．C u与N G B的相互作用使N G B的分子构象发生了变化。

2．2．1荧光猝灭机理

    荧光猝灭作用因机制不同可分为静态猝灭作用和动态猝灭作用静态猝灭是猝灭剂和荧光物质在基态时生成不发光的配合物．从而导致荧光强度降低的过程动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用，是与自身的发射过程相竞争从而缩短激发态寿命的过程。假设荧光体与猝灭剂的荧光猝灭为动态猝灭．则该猝灭服从S t e r n．V o l m e r[6]方程：

／F=1+K s"0 C Q=I+K C Q(1)式中，和F分别为未加入猝灭剂Q及加入猝灭剂Q时N G B溶液的荧光强度；为双分子猝灭常数；。为猝灭剂不存在时生物分子平均寿命约为1 0 4 S；K为S t e r n．V o l m e r猝灭常数；C Q为猝灭剂Q的浓度；显然K=K q Z 0。根据公式f 1 1，将F对C u的浓度作图，得到C u 2+对N G B荧光的S t e r n—V o l i n e r猝灭曲线f见图3 1。

    由图3可以看出．C u 2+对N G B荧光的S t e r n．V o l m e r猝灭曲线是一条直线。由直线斜率求得K为3．2 9 x1 0 3 L·m o l～，那么为3．2 9~1 0“L·m o l·S～。而各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散猝灭常数为2×1 0 1~L．m o l．s一1 1 1 5]显然．C u 2+对N G B荧光猝灭常数大于此值．这说明此猝灭过程不是因为分子扩散和碰撞所引起的动态猝灭，而是分子之间结合形成复合物所引起的静态猝灭动态猝灭只影响荧光分子的激发态．并不改变荧光物质的电子吸收光谱．而如果生成复合物则引起荧光物质的电子吸收光谱的变化。

由图1的吸收光谱可见．加入C u z+后，N G B的2 8 0 n m处的吸收强度增加．吸收峰的形状也发生了变化．进一步说明C u 2~对N G B的猝灭是静态猝灭.

氨基酸序列所决定的.

2．3同步荧光光谱

在蛋白质分子内的3种内源荧光生色团中．常用色氨酸荧光变化来跟踪蛋白构象的变化在普通荧光发射光谱中．3种内源荧光生色团的发射荧光有时会发生重叠而难以区分．但同步荧光光谱能将其分开固定激发波长和发射波长间距f△A 1．同步扫描激发波和发射波。即可得到同步荧光谱图蛋白质的同步荧光光谱已被用来判断蛋白质的构象变化图5所示．由△A=2 0 B 1 T I所得到的N G B的同步荧光光谱最大峰位在3 0 9 n m．其同步荧光光谱是由酪氨酸残基贡献的：由A A=8 0 n m所得到的同步荧光光谱最大峰位在3 5 4 n m处．其同步荧光光谱是由色氨酸残基所贡献_1 9 1对于蛋白的同步荧光．一般说来红移表明蛋白质所处环境的疏水性降低蓝移表明蛋白质所处环境疏水性增强。图5显示．随C u 2+浓度的增加，同步荧光的荧光强度逐渐降低．这与图2中的内源荧光猝灭现象一致酪氨酸的荧光最大发射峰位没变。

 

 

 

 

而色氨酸的荧光最大发射峰位发生了轻微的红移．说明色氨酸所处的微环境疏水性有所降低。经计算发现色氨酸残基的荧光猝灭比酪氨酸残基更显著(见图6)，说明C u与N G B相互作用的结合位点更接近于色氨酸残基。

 

2．4圆二色光谱

    蛋白质在溶液中存在多种二级结构．如O L一螺旋、．折叠、．转角以及无规卷曲等。加入金属离子后．由于金属离子和蛋白质发生相互作用。因此可导致蛋白质的二级结构发生变化在蛋白质或多肽的规则二级结构中．肽键是高度有规律排列的．排列的方向决定了肽键能级跃迁的分裂情况．因此具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生的C D谱带的位置、吸收的强弱都不相同f 2 l】。因此，C D光谱可以灵敏地检测蛋白分子的二级结构变化

 

 

 

 

2 0 8和2 2 2 n m出现双负峰．这是蛋白质中典型的1 9／．螺旋结构的C D光谱特征随着C u+浓度的增加．C D光谱的正峰和双负峰的强度略有减少．而形状和峰位没有发生明显改变通过C D光谱仪附带的杨氏法二级结构分析软件计算．O t．螺旋的含量变化不大．由6 5．6％下降到6 4．9％．表明在铜离子的作用下N G B蛋白的二级结构没有明显的变化与C u使肌红蛋白二级结构的明显改变相比．C u对神经红蛋白二级结构影响较小．也反映了六配位神经红蛋白的高稳定性。这与荧光光谱的研究结果是一致的

3结论

以上研究表明．C u+与神经红蛋白相互作用．使N G B在2 8 0 n m处的吸收强度增强：导致N G B的内源荧光的猝灭．猝灭机制为静态猝灭：C u 2~对神经红蛋白中色氨酸残基的荧光猝灭比酪氨酸残基更显著．表明C u与N G B相互作用的结合位点更接近于色氨酸残基：C u z+使N G B色氨酸的微环境疏水性有所降低．说明N G B的分子构象发生了变化．但并没有引起蛋白二级结构的明显改变同时．铜离子并没有取代血红素内部的铁离子．这与肌红蛋白中的血红素辅基发生的亚铁离子与铜离子的置换㈣存在着显著的不同．这也从另一个方面反应了具有六配位结构的神经红蛋白的高稳定性这些实验结果为研究金属离子与神经红蛋白相互作用提供了有用的实验数据．同时为进一步了解N G B结构与功能的关系提供了一定的参考。