摘要采用超高效液相色谱一电喷雾串联四极杆质谱仪(U P L C—E S I—M S／M S)同时测定蜂胶保健品中1 4种活性成分和9种违禁降糖西药。蜂胶保健品样品用甲醇稀释，超声波提取，样品溶液经高速离心后过滤。使用A C Q U I T Y U P L C C反相柱(5 0 m m×2．1 m m，1．7 i．z m)；流动相为0．3％甲酸溶液和乙腈，在梯度条件下分析，目标分析物在多反应监测(M R M)模式下以保留时间和离子对(母离子和两个碎片离子)信息比较进行定性和定景分析。本方法的活性成分检出限(L O D)为0．7～4 2．0 m g／k g；定量限(L O Q)为2．2～1 4 0 r a g／k g；活性成分的加标同收率为7 7．8％～1 1 3．6％；违禁降糖西药的L O D为0．1～0．9 r a g／k g，L O Q为0．3～2．5 m g／k g；违禁降糖两药的平均叫收率为7 9．3％～1 0 8．5％。本方法简便、有效、灵敏，为评价蜂胶保健品质量提供了新的检测方法

    关键词 超高效液相色谱一电喷雾串联质谱；蜂胶；活性成分；降糖两药

引言

酚酸和黄酮类化合物是蜂胶主要活性成分。现代药理表明这类化合物具有抗菌、抗病毒、抑制肿瘤、降血糖以及治疗心f f f【管疾病等方面的作用。近年来，蜂胶产业发展迅猛，其中用于调节糖尿病患者身体机能的蜂胶保健品居多。若长期服用添加了违禁药物的蜂胶，会发生毒副作用，甚至致死。

蜂胶中黄酮类化合物的检测方法较多，但存在不足之处。紫外分光光度法测定的总黄酮值与实际值有较大的偏差。原因主要是在蜂胶黄酮类化合物中，黄烷醇类或具有糖结构的黄酮可以在A l“显色体系下显红色，而占蜂胶总黄酮的很大比例的多羟基黄酮在这个显色体系下则不能显色、显黄色或者微弱的红色(少数除外)。高效液相色谱法～测定蜂胶中黄酮类化合物时，灵敏度较高，能够满足快速筛选监测需要；但南于缺乏结构信息，不能作为确证依据。庞同芳等采用液相色谱一串联质谱检测法测定蜂胶中黄酮类化合物，然而蜂胶所具有的保健功能不仅仅是黄酮类物质的单一作用。因此，单独以黄酮类成分含量的高低判定蜂胶质量优劣是不科学的。潘建国等报道了蜂胶中含有0．2 2％王浆酸，可以作为鉴别真假蜂胶以及搀假蜂胶的标志成分之一，提供了判定蜂胶质量的思路。目前，利用液相色谱一串联质谱研究违禁降糖西药，主要集中在生物血样、尿样。。和中成药方面，且同时监测的降糖西药种类较少，在保健品中同时对多种降糖西药的检测鲜有报道。

    在以上文献研究的基础上，本研究增加了黄酮类化合物检测范围，并增加了酚酸活性成分等质量控制指标，以便有效鉴别假冒伪劣蜂胶产品，并且对9种违禁降糖西药进行了监测。利用超高效液相色谱一串联质谱检测法，采用多反应监测扫描方式可提供特征的母离子及其子离子信息，为目标化合物的定性与定量分析提供了可靠依据。本方法具有操作简便、定量快速准确、高通量、灵敏度好等优点。

2实验部分

2．1仪器与试剂

    A C Q U I T Y高效液相色谱仪、Q u a t t r o m i c r o T Q三重四级杆质谱仪，配有液相泵、自动进样器、2 0 0 9 4)7—2 2收稿；2 0 0 9-1 1-0 9接受M a s s L y B X数据处理系统(美国Wa t e r s公司)；M i l l i．Q超纯水器(美国M i l l i p o r e公司)；M S 2型漩涡振荡器(德国I K A公司)；K Q-6 0 0 B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；C R 2 1 G型高速冷冻离心机(日本H i t a c h i公司)；0．2 2 m滤膜(美国Wa t e r s公司)；A c q u i t y U P L C C 1 8色谱柱(5 0 m m×2．1 m mi．d．，1．7 m)；氮气与氩气(>9 9．9 9 9％)。甲醇(H P L C级，美国F i s h e r公司)；甲酸(H P L C级，美国A c r o s公司)；阿魏酸(F e r u l i c a c i d)、香豆酸(p-C o u m a r i c a c i d)、咖啡酸(C a f e i c a c i d)、王浆酸(1 0一H A D)、芦丁(R u t i n)、槲皮素(Q u e r c e t i n)、杨梅酮(M y r i c e t i n)、桑色素(M o r i n)、莰菲醇(K a e m p f e r o 1)、芹菜素(A p i g e n i n)、松鼠素(P i n o c e m b i n)、柯因(C h r y s i n)、高良姜素(G a l a n g i n)、刺槐素(A c a c i a)、瑞格列奈(R e p a g l i n i d e)、那格列奈(N a t e g l i n i d e)以及甲苯磺丁脲(T o l b u t a m i d e)标准品(纯度≥9 8％，S i g m a公司)；妥拉磺脲(T o l a z a m i d e)、格列吡嗪(G l i p i z i d e)、格列齐特(G l i c l a z i d e)、格列本脲(G l i b e n c l a m i d e)、格列美脲(G l i m e p i r i d e)以及格列喹酮(G l u r e n o r)标准品(纯度≥9 8％，中国药品生物制品检定所)。标准储备液用甲醇配制，4 q C避光保存，保质期3个月。标准工作液用流动相B从储备液稀释，现用现配。实验用水为经M i l l i—Q净化系统过滤的去离子水；其它试剂均为分析纯(北京化工厂)。降血糖保健品蜂胶胶囊购自北京市各药店。

2．2超高效液相色谱和质谱条件

    A C Q U I T Y U P L C C。色谱柱(5 o m m×2．1 m i l l，1．7 m，美国W a t e r s公司)；流动相：A为乙腈；B为0．3％甲酸水溶液；柱温3 0 o C；流速0．4 r n L／m i n；进样量5。梯度洗脱条件：0～2 r a i n，1 0％A；2～6 mi n，1 0％～3 0％A；6～1 2 mi n，3 0％～5 0％A；1 2～1 3 mi n，5 0％一9 0％A；1 3～1 4．5 mi n，9 0％一1 0％A。电离方式：E S I+；毛细管电压3．5 k V；源温度1 2 0 o C；去溶剂温度3 5 0℃；锥孔气流：1 0 0 L／h氮气；去溶剂气流：6 0 0 L／h氮气；碰撞气压：0．2 6 P a氩气；多反应监测模式(M R M)检测。

2．3样品处理

    准确称取0．1 g蜂胶保健品样品于5 0 m L具塞离心管中，加入2 0 m L甲醇，在超声波水浴中超声2 0 m i n，于4℃下以1 0 0 0 0 r／m i n离心1 0 m i n，并将离心管在4℃下放置2 0 m i n。取出至室温，用甲醇定容至1 0 0 m L，摇匀。用0．2 2 m注射过滤器将试样溶液过滤至样品瓶内，摇匀后，供超高效液相色谱测定。

3结果和讨论

3．1色谱条件的优化

3．1．1流动相的选择考察了甲醇一水、乙腈．水混合溶剂体系作为流动相对目标化合物的色谱行为和离子化程度的影响。结果表明，当流动相为乙腈．水体系时，仪器响应值高于甲醇一水为流动相时的响应值，且乙腈一水体系的柱压低，有利于保护U P L C C。和仪器。其次，在乙腈．水流动相体系中分别加入0．1％甲酸、0．1％乙酸、5 m m o l／L甲酸铵、5 m m o l／L乙酸铵等挥发性试剂，进行了添加后的影响比较。

    结果表明，以乙腈．甲酸水溶液作为流动相获得了最优的色谱分离效果和质谱信号响应。这是由于蜂胶中酚酸、黄酮类化合物和磺酰脲类违禁西药是酸性化合物，当流动相呈酸性时，可以抑制待测组分的解离，增加各组分在固定相上的保留，并改善色谱峰形，从而获得对称的色谱峰。同时，在流动相中加入甲酸有助于色谱柱内硅胶硅醇基的质子化，消除硅醇基与目标化合物之间的相互作用。进一步比较了不同比例的甲酸添加量的影响。由于蜂胶中酚酸化合物极性较强，在U P L C C柱上的保留值低，随着甲酸添加量的增加，目标化合物在U P L C C柱上的保留值增加，有利于各组分的分离；而甲酸浓度过高时，溶液中的酸度偏高，会使目标化合物的响应值降低。甲酸的添加量从0．1％变化到0．5％的结果表明，0．3％甲酸为最佳添加量。

3．2．2流速的选择流速的大小对液相色谱一质谱分析非常重要，即使在有气体辅助装置的电喷雾质谱上，仍然需要在小流量下才可以获得较高的离子化效率。考察了0．2～0．5 m L／m i n流速范围内，2 3种目标化合物的色谱分离效果和质谱信号响应。实验结果表明，在U P L C 0．4 m L／m i n流速下，2 3种目标化合物的分离效果、分析时间、质谱响应值和色谱柱的柱压均比较理想，目标化合物类化合物在0．4 m L／m i n流速下具有较小的色谱峰展宽，有利于提高离子源的效率，并与电喷雾质谱能够承受的流速完全匹配，从而兼顾了目标化合物的最优色谱分离条件和质谱分析条件。

3．3质谱条件的确定

3．3．1检测方式的确定E S I属于软电离，可以获得足够的分子碎片信息。本研究采用液相色谱．电喷雾四极杆串联质谱作为蜂胶的黄酮类化合物和违禁降糖西药检测的工具。同时，按照欧盟标准¨的要求，选取1个母离子及2个子离子或2个母离子及各1个子离子，并依据子离子相对丰度比即离子比(定性离子／定量离子)和化合物保留时间定性。

3．3．2质谱条件的优化将标准品配制成1．0 m g／L的乙腈-0．3％甲酸水溶液，通过流动注射泵连续进样，调谐质谱参数。对2 3种目标化合物的质谱条件进行优化，在正离子和负离子模式下进行全扫描，以选择适当的分子离子峰和电离方式。结果显示，多数目标化合物在正离子模式下容易形成分子离子[M+H]；而蜂胶黄酮在E S I-4-和E S I一两种模式下都可以电离，形成分子离子[M+H]和[M—H]一。考虑到多数黄酮类目标化合物在正离子方式可以提供较负离子方式更多的碎片信息，同时E S I+具有更高的响应值，实验采用E S I+检澳0。

     在质谱扫描速度一定的情况下，为保证质量色谱峰的真实性，必须在色谱上尽量分离，分段扫描。采用乙腈．水一甲酸流动相体系，其中，甲酸可以提高药物在E S I+模式下的电离效率，促进生成[M+H]离子。保证了药物在正离子模式下的电离效果；采用A c q u i t y C。U P L C色谱柱、梯度洗脱方式，根据药物保留性质的差异，将M R M分为5个扫描时间段，保证每个峰的至少1 0个采集点数。结合基质空白和基质标准液的离子扫描图，优化参数，从而相应地确定了在正离子切换模式下同时检测2 3种药物，在多反应监测模式下监测各两个选择反应离子对，信号采集的特征离子对见表1