H P L C-I C P-MS研究炮制对中药砷形态的影响

    摘要应用高效液相色谱电感耦合等离子体质谱联机技术(H P L C-I C P-MS)建立了中药中A sⅢ，A s，MM A和D MA等四种砷形态的同时测定方法，用该方法对黄芪、大黄、黄芩、何首乌、地黄等五种中药炮制前后砷形态的变化进行了比较研究，并埘一个总砷超标的冬虫夏草样品进行了砷形态的分析。方法学验证表明：四种砷形态的线性相关系数(r)都大于0．9 9 8 4，定量限(L O Q)都在0．8～1．o g·L一之间，重复性和稳定性的相对标准偏差(R S D)都小于l o，加标回收率都在8 2．4 o～1 1 9．5之间。测定结果显示：中药中的砷形态以无机砷(A s和A s)为主；植物来源中药中都未检m MMA和D MA，但冬虫夏草中检出了MMA；炮制后，五种中药尤机砷的含茸都出现了上升。

    关键词 高效液相色谱一电感耦合等离子体质谱；中药；炮制；砷形态

引言

    中药中的砷(A s)含量向来是各国法规关注的重点l】j。现代药理表明，砷元素的毒性与其存在形态密切相关L 2 J：三价砷(A s)和五价砷(A s)属于无机砷，毒性很强，其中又以A s的毒性最强；单甲基砷酸(MMA)和二甲基砷酸(D MA)属于有机砷，有一定毒性，但毒性远远小于无机砷；砷胆碱(A s C)、砷甜菜碱(A s B)以及各种类型的砷糖(A s S)和砷脂(A s L)等形态在海洋生物中分布较多，足几乎无毒的。因此，要全面评价中药砷毒性，单纯考察砷总量是不够的，还应考察各种砷形态的含量，特别是无机砷的含量。炮制是中医用药的重要特点，中药经过炮制后，药性、药效、毒性等方面都可发生改变。本文应用高效液相色谱电感耦合等离子体质谱联机技术(H P L C I C P—MS，h i g h p e r—f o r ma n c e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y-i n d u c t i v e l y c o u p l e d p l a s mam a s s s p e c t r o me t r y)，对一个总砷超标的冬虫夏草样品进行了砷形态分析，还考察了五种常用中药炮制前后砷形态的变化，为中药的毒理研究提供了参考。

1仪器与试药

    电感耦合等离子体质谱仪(I C P-MS)Ag i l e n t 7 5 0 0 a(A g i—l e n t Te c h n o l o g i e s C o．L t d，US A)，卜习心雾化器，镍采样锥和截取锥。A g i l e n t】1 0 0型单元泵液相色谱系统、A g i l e n tG 3 1 5 4—6 5 0 0 1阴离子交换树脂柱(4．6 m m×1 5 0 i n I n，5 m)(美国安捷伦公司)，K Q-8 0 0 K D E型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)，C~6 K R c e n t r i f u g e低温高速离心机(B E C K MA N公司)，超纯水处理系统(法国MI L I I P O R E，S y n t h e s i s)，ME 1 v r L E R T O L E／X)X P 2 0 5电子天平(瑞士梅特勒公司)，1 0 1 A-2型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器总厂)，R T-0 2 A型粉碎机(北京环亚天元机械技术有限公司)，L A B 0 R()T A4 0 0 0旋转蒸发仪(德国HE I D OL P H公司)。A s标准溶液(G B W0 8 6 6 6)、A s标准溶液(G B WO 8 6 6 7)、MM A标准溶液(G B W0 8 6 6 8)、D M A标准溶液(G B W0 8 6 6 9)均购自国家标准物质研究中心。调谐液为，Y，C e，T l，C o混合液(1 0／l g·I)，Ag i l e n t公司产品，编号5 1 8 4—3 5 6 6。超纯水由MI L L I P O R E超纯水系统制得。

2方法

2．1 H P I c_I C P_MS工作参数

    流动相为2 mmo l·I的NH H2 P()4和0．2 mmo I·L_1的E D T A(氨水调至p H 6．o)，流速为0．8 m I·m i n一。R F功率l 5 0 0 w；采样深度7．2 n m1，载气流速(C a r r i e rG a s)0．6 2 L·m i n，补充气流速(Ma k e u p G a s)0．4 L·m i n～，蠕动泵转速1 8 r·m i n一，雾化室温度2℃，采样模式为T i m e R e s o l v e d A n a l y s i s；峰模式T R A采样元素为A s和C l，元素的积分时间0．5 S。

2．2中药样品

    黄芪(产地：内蒙)、大黄(产地：甘肃)、黄芩(产地：河北)、何首乌(产地：河南)、地黄(产地：河南)均购自北京崇光药业有限公司；冬虫夏草(产地：青海)为药房送检样品。炙黄芪、熟大黄、洒黄芩、制何首乌、熟地等炮制品都由所购生约按照《【f J药典》规定的标准方法l 3]炮制而得。以上样品经粉碎机粉碎后，过7 O日筛，烘箱(7 0±2)o C烘干，置于干燥器中备用。冬虫夏草按照前期工作建的方法]测定总砷含量。

2．3供试品溶液的制备

    精密称取巾药样品或中药炮制品0．5 g于离心杯中，加5 O()醇溶液1 O mL浸泡1 h，超声提取3 0 r ai n，离心机5 0 0 0 r·r a i n_1离心1 5 r a i n，倾出离心液，滤渣继续提取2次，合并离心液，旋转蒸发仪4 0℃减压浓缩至近干，用超纯水转移至1 0 mI聚乙烯容量瓶巾，定容，摇匀，0．2 0／x m微孔滤膜滤过。冬虫夏革供试品溶液按前期工作建立的方法…测定砷总量；冬虫夏草的提取砷含帚一供试品溶液的砷总量／供试品称样髓。

2．4标准溶液的制备

    精密吸取四种砷形念的标准溶液适量，先用超纯水制备浓度为1 0 0 0 g·L’(以A s计)的各形态储备液，再精密吸取四种形态的储备液，用超纯水稀释制备六个浓度梯度的混合标准溶液，混合标准溶液中，A s和A s的浓度分别为：0，1 0，2 0，4 0，1 0 0和2 0 0 g·I。；MMA和D MA的浓度分别为：0，2．5，5，1 0，2 5和5 O g·I。

2．5测定方法和计算

    取六个浓度混合标准溶液，分别进样2 O L，记录总离子流色谱图，以色谱图中四种砷形态色谱峰的峰面积为纵坐标，相应的质量浓度为横坐标，作标准曲线。各供试品溶液也分别进样2 0 L，通过标准曲线的校正获得四种砷形态的浓度，并根据稀释倍数，计算样品中各种砷形态的含量。

3结果与讨论

3．1方法学验证

3．1．1线性和定量限

    四种砷形态的标准曲线方程，线性相关系数(r)见表1。

    取混合标准溶液，，}{{超纯水逐级稀释，直至总离子流色谱图中各形态色谱峰的信噪比(S／N)约为1 O的浓度为该形态的定量限(L OQ)。四种砷形态的定量限见表1。

3．1．2重复性、稳定性和回收率

    精密称取冬虫夏草粉末0．5 g，按“2．3”项下的规定操作，平行测定六份，计算各形态含量的平均值及R S D。样品未检出D MA。A sⅢ，M MA和A s的R S D分别为1．1 8，2．7 1％和4．1 8％，重复性良好。选取一份4℃冰箱保存的供试品溶液分别于1，3和5 d测定，A sⅢ，MMA和A s的R S D分别为4．4 6，1．8 9和5．1 2，表明5 d内稳定性良好。

     精密称取冬虫夏草粉末0．5 g于离心杯中，并在每杯中精密加入各形态储备液适量，按“2．3”项下的规定操作，平行测定三份，以加标前后测定的含量平均值计算各形态的回收率。本方法中高、中、低三个浓度的加标回收率都在8 2．4 O～1 1 9．5之间(见表2)。

3．2样品测定及结果分析

    应用建立的方法对冬虫夏草进行_r砷形态的分析，并对黄戈、大黄、黄芩、何首乌、地黄五种中药材炮制前后的砷形态变化进行r研究。每个样品测定3次，取平均值。砷形态的典型总离子流色谱图见图1，样品测定结果见表3。

    从砷形态的分析结果来看：(1)无机砷(As和As)在中药砷形态中占绝对多数；(2)所有植物来源中药都未检出MMA和D MA，这和王小如课题组的研究结果Ⅲ一致，提示植物类中药很可能对砷元素不具备甲基化代谢功能；但在冬虫夏草中检出了MMA，表明冬虫夏草对砷元素具有一定的甲基化代谢功能，这可能和冬虫夏草是真菌和昆虫的复合体有关；(3)冬虫夏草中A s，A s和MMA的含量总和为1．2 3／l g·g，仅占其总砷含量(2．1 2 g·g)的5 8％，提取砷含量(1．6 5 g·g)的7 4％，提示冬虫夏草中还存在一定比例的(2 6～4 2)未知结构砷形态，有待深入研究；(4)黄芪等五种中药材炮制后的无机砷含量无一例外地出现了上升，具体机理有待进一步深入研究。

4讨论

4．1分析方法的选择

    目前，砷形态分析的热点在海洋动植物，巾药砷形态分析的报道很少[4间。海洋动植物中砷含量高，形态丰富，分析相对容易；中药，特别是中草药，砷含量很低，要分析其中微量的砷形态，对方法灵敏度的要求很高。H P L C q C P-M S是2 0世纪9 O年代后期新发展起来的联机技术，兼有H P L C的分离功能和I C P-MS的元素分析功能，专属性和灵敏度都很高，是中药砷形态分析的发展方向。

4．2流动相的选择与优化

    传统方法多采用N a H z P O 4或K H z P O 4作为砷形态分析流动相的缓冲盐，其中的N a和K元素在I C P-MS中很容易解离，长期运行含有较高浓度N a和K元素的流动相会对仪器产生损害。本方法采用N H 4 H 2 P O 4作为缓冲盐，其分离效果和N a H P O相当，但N H}I在仪器中不会解离，因而也不会对仪器造成损害。对流动相p H值的优化时发现，p H在4．O～6．0之间，四种砷形态都能得到基线分离，但p H为6．0时峰形最佳。