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   【摘要】目的分析激素耐药性肾病伴泌尿生殖器异常患儿的临床特点、”基因及足细胞分子表达，提高对”基因突变在该类疾病的重要致病作用的认识。方法收集3例激素耐药性肾病伴有或怀疑有泌尿生殖器异常的患儿。采用P C R及R T—P C R的方法分析”基因及+K T S(赖氨酸一苏氨酸一丝氨酸)／一K T S比例；采用间接免疫荧光及免疫组化的方法进行足细胞分子(n e p h f i n，p o d o c i n，o t—a c t i n i n 4，"及C D 2 A P)表达。结果3例患儿发病年龄分别为6个月、1岁及1 O岁；2例为男性伴泌尿外生殖器异常，1例为男性假两性畸形；临床均表现激素耐药肾病，2例肾脏病理为局灶节段性肾小球硬化。2例检测到删突变，即”I V S 9+5 G>A和”外显子9 1 1 8 6 G>A杂合突变。足细胞分子在"突变肾组织表达发生改变；1例无”表达，1例”在足细胞细胞核内的分布与正常对照不同。结论对于激素耐药性肾病的女性患者或伴有泌尿生殖器异常的男性患者应行染色体核型和"基因分析。”突变除可能引起+K T S／一K T S比例异常，还伴有足细胞分子表达异常，从而导致蛋白尿的形成和(或)发展。

【关键词】肾病综合征；激素耐药；泌尿生殖器异常；足细胞

    肾病综合征(N S)为儿童常见的肾脏疾病之一，约8 0％的患儿对激素敏感，预后良好；但仍有2 0％的患儿呈激素耐药，其中多数最终发展为慢性肾衰竭。近年国外的研究表明多个足细胞分子基因突变可致先天性肾病综合征(C N S)／家族性N s，这类肾病亦表现为激素耐药，预后差；国外资料还提示一些激素耐药性肾病(S t e r o i d—r e s i s t a n t n e p h r o t i cs y n d r o m e，S R N S)可能伴有泌尿生殖器异常和"基因突变，应引起临床医生高度重视，以便于获取临床、肾脏病理以及基因序列等方面信息进行早期确诊和制定针对性治疗方案。因此，我们报道并分析表现为S R N S伴有泌尿生殖器异常患儿的临床特点和时基因检测结果，并初步探讨足细胞在"突变肾组织表达。

对象与方法

1．研究对象：2 0 0 5年1月至2 0 0 7年5月，我院收治的表现为S R N S、伴有或怀疑有泌尿生殖器异常的患儿共3例。

2．方法：(1)间接免疫荧光及免疫组化：对储存于一2 0℃的肾组织(例1)行间接免疫荧光染色，对石蜡包埋的肾组织(例2)行免疫组化染色，并以因肾肿瘤而行肾切除的肾脏的正常部分作为正常对照。所用一抗分别为兔抗人"多克隆抗体(美国，S a n t a C r u z公司，S C一1 9 2)、兔抗人n e p h r i n多克隆抗体(瑞典卡罗林斯卡研究所，K a r l T r y g g v a s o n教授惠赠)，兔抗人p o d o c i n多克隆抗体(法N e c k e rH o s p i t a lC o r r i n e A n t i g n a c教授惠赠)、鼠抗人仅一a c t i n i n 4单克隆抗体(美国，S a n t a C r u z公司，S C一1 5 3 3 5)；兔抗人C D 2 A P多克隆抗体(美国，S a n t aC r u z公司，s c-9 1 3 7)。二抗分别为F I T C标记的羊抗兔多克隆抗体和羊抗鼠多克隆抗体(美国Z y m e d公司)以及试剂盒P V．9 0 0 0(G B I)和D B A显色剂。实验中以P B S代替一抗作为实验的空白对照。①间接免疫荧光染色方法如下：肾组织冰冻切片(5 m)以丙酮固定(一2 0℃，1 0 r a i n)，正常羊血清封闭3 0r a i n，再依次用一抗(3 7℃，9 0 r a i n)及F I T C标记的二抗孵育(室温，4 5 r a i n)，9 0％甘油封片。②免疫组化染色方法如‘卜：肾组织石蜡切片(4 m)脱蜡，高压锅(1 2 1℃，4 i n i n)修复(1 0 m m o l／L枸橼酸盐缓冲液中，p H 6．0)，正常羊血清封闭3 0 m i n，依次加一抗(3 7℃，9 0 r a i n)孵育，加P V一9 0 0 0试剂(按照说明)孵育，D A B显色，中性树胶封片。所有图像由两人独立在O l y m p u s显微镜下观察。

    (2)基因组D N A基因分析：①基因组D N A提取：采用盐析法从患者外周血提取D N A用于基因分析。②P C R扩增及直接测序："基因外显子1～1 0的扩增引物采用p r i m e r 3在线软件进行引物设计(表1)。"基因外显子2～1 0的扩增条件为：2 5 l反应体系中加入5 p m o l／l~l正反向引物各1 t x l。5 0 n g／t x l DN A 1 t x l，1 2．5 t x l 2×T a q p l u s Ma s t e rM i x(北京天根生化公司)，由于"基因外显子1的G C含量高，其P C R反应体系中使用T a k a r a公司的T a k a r a L a T a q E(5 U／t x 1)酶及2×G C B u f i e rⅡ。反应条件均为9 4℃预变性7 r a i n后，9 4℃变性3 0 S，6 4℃退火3 0 S，7 2℃延伸4 5 S，循环2次，此后每2个循环退火温度降低1℃直至5 9℃，后退火温度5 8℃循环2 6次，最后7 2℃延伸7 m i n结束。P C R产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后送北京诺赛基因测序公司采用A B I 3 7 3 0 X L测序仪进行测序。

    (3)"基因+K T S和一K T S比率分析：①总R N A提取及c D N A合成：采用T r i z o l(i n v i t r o g e n)法提取E B V转染的淋巴细胞的总R N A，取2 g总R N A，以r a n d o m h e x a m e r s(P r o m e g a C o．)为引物，M．M L V逆转录酶(P r o m e g a C o．)催化进行c D N A第一链合成。@P C R扩增及+K T S和一K T S比率测定：采用P r i m e r 3在线引物设计软件设计包含了K T S序列的片段长3 5 9 b p的扩增引物，正向引物为唧一R T·L：5一C I r r G T C A G C G A A A G T T C T C C一3，反向弓I物为I 7 Y．R T．R：5．C C A G G C A C A C C T G G T A G r I t I T I 1—3。扩增产物经2％琼脂糖凝胶鉴定后送北京诺赛基因测序公司采用A B I 3 7 3 0 X L测序仪进行测序，采用荧光标记的引物正向为一R T．L：5．F A M—

C T Y G T C A G C G A A A G T Y C T C C-3，反向为．R T—R：5，_C C A G G C A C A C C T G G T A一3，进行P C R扩增后，产物经2％琼脂糖凝胶鉴定后送诺赛公司进行G e n e S c a n扫描，结果用G e n e S c a n 9．1软件进行+K T S和一K T S比率分析。

结果

    1．临床特点(表2)：例1，男，1 4岁，因“间断浮肿、蛋白尿4年”于2 0 0 5年1月人院。患儿人院前4年出现间断眼睑浮肿及大量蛋白尿，给予足量泼尼松治疗6个月尿蛋白无缓解；病程中无少尿、血尿、高血压；病理为F S G S；人院后给予泼尼松、环孢素A(C s A)及间断甲泼尼龙(M P)冲击治疗1年余，尿蛋白始终无缓解；因外生殖器畸形曾于泌尿外科行隐睾手术；其父母为表兄妹近亲婚配。目前随访3年，血B U N、C r尚在正常范围内，尿蛋白无缓解。

    例2，女，8岁，因“间断浮肿、蛋白尿7个月”于2 0 0 6年3月入院。患儿入院前7个月出现间断眼睑浮肿及大量蛋白尿，曾先后应用泼尼松、环磷酰胺(C T X)、C s A及M P冲击治疗尿蛋白仍未缓解；病理为F S G S；盆腔B超检查提示始基样子宫，无性腺。追问病史获悉患儿1岁时因“尿频”查尿蛋白(+++)，抗炎治疗后尿蛋白阴转，未再随访；其父母非近亲婚配；确诊后停用激素和免疫抑制剂，仅服用血管紧张素转化酶抑制剂(蒙诺)，目前随访2年余，血B U N、C r尚在正常范围内，尿蛋白无缓解。

    例3，男，7个月，因“浮肿、蛋白尿1月余”于2 0 0 7年3月人院。患儿于人院前1月余出现间断眼睑浮肿及大量蛋白尿，无少尿、血尿和高血压，肾功能正常；给予泼尼松治疗尿蛋白无缓解；查体发现隐睾和尿道下裂；父母非近亲婚配；未行肾穿刺；确诊后停用激素治疗，仅服用血管紧张素转化酶抑制剂(蒙诺)，3个月后电话随访尿蛋白尿(+++)，未查肾功能。

    2．肾组织足细胞分子表达(图1，2)：例1(免疫荧光染色，I F，图1)：在对照肾组织，n e p h r i n、p o d o c i n沿着肾小球基底膜(G B M)呈均匀、线状分布，O t—a c t i n i n 4沿着肾小球G B M呈点状分布，在系膜区有少许染色；C D 2 A P沿着肾小球与肾小管G B M呈线状分布；唧分布于足细胞的细胞核。在患儿肾组织，n e p h r i n在肾小球G B M呈点线状分布伴广泛缺失；p o d o c i n沿着肾小球G B M呈点线状分布伴缺失；O t—a c t i n i n 4在肾小球G B M分布不均、呈点线状分布伴部分缺失；C D 2 A P沿着肾小球G B M呈点线状分布伴部分缺失，在肾小管分布无明显改变；W T 1在肾小球足细胞细胞核无表达。

    例2(免疫组化染色，I H，图2)：在对照肾组织，n e p h r i n，p o d o c i n和O t．a c t i n i n 4沿着肾小球G B M呈均匀线样分布，C D 2 A P沿着肾小球G B M呈点线状分布，在肾小管亦有表达；在患儿肾组织，n e p h r i n、p o d o c i n在硬化或非硬化的肾小球表达强度均减弱，沿肾小球G B M间断线样分布伴广泛缺失，O t—a c t i n i n 4染色强度无明显改变，呈点线状分布且广泛缺失；C D 2 A P染色强度无明显改变，呈点线状分布伴广泛缺失，在肾小管分布无明显改变。在对照肾组织，唧弥漫分布于足细胞的细胞核并伴有明显的斑点状染色现象，在患儿肾组织，唧弥漫分布于细胞核，斑点状染色不明显。

   3．"基因分析(图3)：例1未检测出突变；例2检测出W T／I V S 9+5 G>A杂合突变(图3 A)，检测患者父母未发现该基因突变。例3检测出WT1

与罹患泌尿生殖系统肿瘤，其中肾病是首要的条件。D D S和F’S也具有不同的特点[1 1-1 2]，D D S多表现为快速进展性肾病、生后1年内进人终末期肾病(E S R D)、肾脏病理为D M S、患Wi l m s瘤、常见外显子8、9错义突变；而F s则多表现为缓慢进展性肾病、1 0余岁进人E S R D、肾脏病理为F S G S、患性腺母细胞瘤、常见内含子9剪切位点突变。

例1患儿的临床特点：①起病隐匿(即大量蛋白尿却无浮肿)；(~)S R N S，肾脏病理为F S G S；③泌尿外生殖器异常；④父母为近亲婚配。故首先考虑删突变的可能性，加之检测足细胞分子表达时无表达，尽管本研究在聊所有外显子均未发现突变，但仍不除外基因内突变的可能性，因为该患儿存在基因编码蛋白的异常。

例2患儿临床特点：①女性表型；②早发肾病(1岁时出现大量蛋白尿)；③S R N S，肾脏病理为F S G S。文献报道在小于1 8岁的S R N S患儿中，"突变的检出率为6％～7％，而在女性表型的患儿中高达1 0％～1 2％l，且主要集中在删外显子8和9。突变在核型为4 6，X X的女性患者中，往往表现为单纯性S R N S；而在核型为4 6，X Y患者中，可以表现为男性伴泌尿外生殖器异常及S R N S，也可以表现为男性假两性畸形伴S R N S。由于男性假两性畸形患者在青春期前从外观上与正常女性并无区别。一些患者往往在肾移植后，因为原发性闭经才发现为男性假两性畸形及突变H。因而，学者主张对所有女性表型的S R N S患者或男性伴有外生殖器畸形的S R N S患者行染色体核型和”基因分析。以达到早期发现突变病例孓。根据本患儿表现为缓慢进展性肾病(肾脏病理为F S G S)、男性假两性畸形、删I V S 9+5 G>A，故确诊为F s，为国内首例报道。该病例还提示应对女性表型的S R N S患者进行染色体核型和基因分析。

例3患儿临床特点：①早发肾病：生后6个月发现大量蛋白尿；②S R N S；③外生殖器异常。结合突变表现为S R N S伴泌尿生殖器异常，对该患儿首先行"基因分析，结果发现外显子9(1 1 8 6 G>A。D 3 6 9 N)突变，为D D S常见突变位点，如果患儿病理为D M S且快速进展到E S R D则支持D D S诊断；但患儿肾功能在正常范围内，且未行肾脏病理检查，因而尚不能确定为D D S还是F s，有待于随访肾功能进展情况。此外，随着越来越多的聊突变病例的报道，人们发现D D S和F S之间不论从临床表现到基因突变类型均有重叠，有学者提出应该将这两个综合征看成是删突变的两个谱而非两个独立的疾病¨’堪J。

    目前3例患儿均未发现泌尿生殖系统肿瘤。D D S分为完全和不完全两型l l，Wi l m s瘤并非诊断D D S的必要条件，且Wi l m s瘤可出现在肾病前／后；对于F s，研究显示患者迟早出现性腺母细胞瘤，但是影像学检查很难早期诊断，需要通过预防性病理活检来证实l 2。。，本文例2患儿家长尚不能接受预防性性腺切除故未行病理检查，因而3例患儿目前未发现肿瘤。

    针对基因突变所致S R N S患者，积极的免疫抑制治疗不但不能获得尿蛋白缓解反而增加药物副作用，故早期诊断可以避免不必要的药物治疗。本组患儿均使用激素治疗，尤其例1和例2长期使用激素和免疫抑制剂治疗，尿蛋白尿始终无缓解，且给家庭带来沉重的经济负担，确诊突变后即停用激素和免疫抑制剂治疗，长期正规的随访至关重要。突变的遗传模式复杂多样，多为新发(d eI I O V O)突变，以负显性的方式起作用；有患病母亲遗传给下一代的病例报道l 2；也有报道同胞3人均为同一位点突变，但其父母并无相同位点的突变.本文3例患者均为独生子女，没有肾病家族史，其父／母行基因分析均未发现相同位点的突变，提示为新发突变。

    2．足细胞分子在"突变肾组织的表达：为核转录因子，对多个靶基因的转录具有激活或抑制作用，动物实验显示对足细胞分子n e p h r i n等具有调节作用。本文通过对"突变病例进行足细胞分子表达以探讨足细胞分子表达特点，结果显示足细胞分子表达发生改变(包括表达强度和分布)，提示足细胞分子确实参与了”突变所致蛋白尿的发生或发展，尽管其具体的机制尚有待进一步研究。本研究还显示在病例2(删I V S 9+5 G>A)和正常对照肾组织的分布不同，在对照肾组织，”弥漫分布于细胞核并伴有明显斑点状染色，在患儿肾组织，弥漫分布于细胞核，而斑点状染色不如正常对照明显。含有2种亚型，即+K T S(赖氨酸一苏氨酸一丝氨酸)和一K T S，正常情况下2个亚型的比例恒定，”I V S 9+5 G>A突变并不产生新的蛋白质，只是减少了+K T S而增加了一K T S，因而删由斑点状变为弥漫分布提示+K T S与一K T S在人类肾小球足细胞的细胞核内分布部位不同，+K T S可能呈斑点状分布，而一K T S可能呈弥漫分布，本研究首次在体内观察到这种现象；本课题组及其他研究组对非遗传性肾病肾组织进行足细胞分子表达，未见报道这种现象。因此，提示在突变病例和获得性肾病肾组织的表达不同，这可能为针对蛋白尿分子机制的研究提供信息，同时为临床基因检测提供信息。

    总之，本研究提示对早发S R N S患者，应注重对泌尿生殖系统进行详细的体格检查以及对女性表型患儿行染色体核型分析；此外应尽可能进行基因分析，以早期诊断、避免盲目使用激素和免疫抑制剂。本研究显示，突变引起足细胞分子表达异常，以及提示+K T S与一K T S在人类足细胞的细胞核内分布部位可能不同，这些结果将有助于进一步探讨删突变的致病机制。