大鼠原位肾移植模型的建立

【 摘 要】   目的 为 进 行 移 植 免 疫 研 究 的 需 要 ， 建 立 一 种 大 鼠 肾 移 植 模 型 。方 法  采 用 原 位 低 温 灌 注 、 手 术 显 微镜 下 原 位 端 —— 端 吻 合 肾 动 、 静 脉 ， 将 输 尿 管 带 膀 胱 瓣 吻合 于 膀 胱 。 结 果 建 立 了 稳 定 可 靠 的 大 鼠 肾 移 植 模 型 ，手 术 成 功 率 为 8 6   。结 论 此 方 法 建 立 的模 型 稳 定 可靠 ， 较 为理 想 的 满 足 了 肾 移 植 研 究 的 需 要 。

【 关键 词】 肾 移 植 ； 动 物模 型 ； 大 鼠

【 中 图 分 类 号】 R   6 1 7   【 文 献标 识码 】 A

大 鼠肾移 植模 型是 肾移 植研 究 中一种 理想 的动物模 型 。从 F i s h e r [ 1 ]  描 叙 以来 ， 有 多 位 学 者[2-9]建立 了各 种建 模 方 法 ， 大 致 可 分 为 F i s h e r [ 1 ]  或 F a b r e法 吻合 动 脉 ， 静 脉 F a b r e 法 吻 合[ 4 ]或 C u f f 管 套 扎法 [ 5 ] ， 输 尿 管 重建 主 要 有输 尿 管 带 膀胱 瓣 吻 合 和 内支 架管 吻 合 [ 7 ,8] 。D a n i l l e r 等 人 最 早 完 成 大 鼠原 位肾移植[ 9 ] 。但 以上 方法 未能 在解 剖上恢 复供 肾的位置 ， 影 响供 肾 的灌 注 ， 或者 是把 肾动 、 静 和腹 主动 脉 、下 腔静 脉端— —侧 吻合 ， 易 发生 吻 合 口大 出血 。我们 通过 在前 辈基 础上 摸索 经验 ， 采用 原 位 肾移植 ， 肾动 、 静 脉直 接端 一 端 吻合 ， 输尿 管带 膀胱 瓣 吻合 于膀胱 ， 建 立 了一种 可靠 稳定 的大 鼠原 位 肾移植模 型 ， 为更好 的开 展 肾移植研 究 奠定 实验 基础 。

材 料 和 方 法

材 料 供体 为 S D雄性 大 鼠， 约 2 5 0   g 。受 体 分△ 通讯作者 Te l ： 0 2 1 - 6 4 0 4 1 9 9 0 - 2 9 0 6为 2 组 ， 分 别 为 S D 组 和 Wi s t a r 远 交 系 组 ， 均 为 雄性 ， 约 2 5 0   g 。手术显 微镜 X   1 0 倍 ， 显 微缝 合 线 1 1 — 0和 8 - 0 ， 戊 巴 比妥钠 4   m g ／ mL ， 肝 素 2 5 0  ／ mL ， 乳 酸林格 氏液 ， 青霉 素钠 注射 液 。

材 料 和 方 法

麻醉 均用戊 巴比妥腹 腔 注射 ， 剂 量 为 3 2   r a g ／k g 体重 。

供体 手 术 麻醉 成 功 后 ， 肌 肉 注射 肝 素 5 0 0   U 。取 腹部 正 中切 口， 从 剑突 下至 耻骨上 ， 用 自制 小拉 钩于切 口两边 牵 引 ， 用 湿盐 水纱 布拖 出覆 盖肠 道 ， 充 分暴 露左 肾、 腹主 动 脉 和 下 腔静 脉 。从 肾脏 上 极 或 下极 开 始游 离至 肾蒂 ， 再从 肾动 静脉 根部 开始 游离 肾 、动静 脉起 始部 ， 分别 结扎 、 切 断 肾上 腺静 脉 和性 腺静脉 ， 分离 至 肾动静 脉 1 ／ 2 ~2 ／ 3长 即可 。在 肾动 脉 以下 水平 的腹 主 动 脉 穿 3 - 0线 备 用 ， 分 别 在 肾动 脉 上下 水平 钳夹 阻 断腹 主 动 脉 和 下腔 静 脉 ， 在 腹 主动 脉穿 线处 剪一 约 2   m m 小 口， 插 入 硬 膜 外 麻 醉 导 管 至肾动 脉水平 ， 结 扎 固定 ， 再 剪 开 下腔 静 脉 ， 用 0 ～4 。 C的 2 5 0   U ／ mL肝 素林 格 氏液 接 导管 灌 注 ， 灌 注 速 度保 持 在 0 ． 5   m L ／ s ， 至 肾脏 灰 白 ， 下 腔 静 脉 流 出 的灌注液 清亮 为止 ， 一 般灌 注量 为 1 5 ～ 2 0   mL 。于近 腹主动 脉 1 ／ 3 处 剪断 肾动静 脉 ， 游离 输尿 管 至膀胱 ， 带膀胱 壁取 下 肾脏 ( 图 1 ) 。手 术 时 间约 2 0 ～2 5   m i n ，供 肾热缺 血时 间约 3 0 ~6 0   s 。

供 肾 的修 整  置 以上 供 体 于 冰水 中 ， 进 一 步 去除 肾动 、 静脉 断端 残余 的脂 肪及 多余 的外 膜 ， 修剪 膀胱 ， 保 留输 尿 管 开 口周 围 约 3   mm 膀 胱瓣 ， 0 ～ 4 。 C肝 素林 格 氏液保 存 ， 以上 约需5   mi n 。

受体 手术  按 以上所 述 的方 法游 离 左 肾动 、 静脉 后 ， 于根部 用 L e e 夹 分别 阻断 ， 在 动 静 脉 中 间 1 ／ 2处 剪 断 ， 结扎 切 断输 尿管 ， 取 出肾脏 。 自制小 的带 洞纱 布 袋 ， 放 人供 肾 ， 用 1 1 - 0线 两定 点 法 间 断 吻合 肾动脉 ， 先 吻合腹侧 ， 然后 把 肾脏 沿 纵 轴 翻转 1 8 0 。 ， 缝合 背侧 ， 共 8 针 。此 时 ， 先 从 阴茎 背 静 脉 补 液 5   mL后 ， 再 用两 定点 法 连续 缝 合 肾静 脉 ， 也 先 吻合 腹 侧 ，然后 纵轴 翻转 肾脏 ， 缝合 背侧 ， 每 侧 6 ～8针 ， 与 对侧缝 线 作结 ， 但 不要 打结 至静脉 壁 。开放 动静 脉 ， 可见肾脏 于 2   s 内迅 速 变 红 ， 肾静 脉充 盈 ， 观 察 约 3 ～5m i n ， 可见输 尿 管蠕 动 ， 并 有 尿液 流 出 ， 用 8 - 0线 间断缝合 膀胱 瓣 于膀胱 。一 期 切 除对 侧 肾脏 ( 图 2 ) 。腹腔补 液 5   mL ， 加青 霉素 钠 8 万 u ， 3 - 0 线 分 两层 连续缝合 伤 口。准 备 供 体 约 2 0 ～ 2 5   m i n ， 吻 合 动 脉 约1 0 ～ 1 5   m i n ， 静 脉约 1 0   m i n ， 吻合 膀 胱瓣 约 1 0   m i n ，切 除右 肾和缝 合 伤 口约 1 0   m i n 。包 括 供 、 受 体 所 有手 术时 间约 1 3 0 ～ 1 5 0   m i n ， 其 中供 肾冷 缺 血 时间 为5 5～ 6 0   m i n。

术后 注意 保 温 ， 即 时 自 由饮 水 ， 2 4   h后 自 由进食 ， 术后 前 3天 1鼠 1 笼 。观察存 活期 。

结  果

据 以往试 验 ， 大 鼠失 去 双 肾将 在 2 4   h内死 亡 ，故 一般认 为 ， 受体 术 后 3   d内 死 亡 考 虑 是 死 于 手 术并 发症 ， 移植 手术 失败 ， 术 后存 活超 过 3   d则移 植 手术 成功 。本 试 验共 移 植 6 0例 ， S D 和 Wi s t a r s 远 交系 受体 各 3 0例 ， 有 8 例 术 后 3   d内死 亡 ， S D 组 3例 ， 移植 成功 率 为 9 0   ， Wi s t a r 远交 系 组 5 例 ， 移 植成 功率 为 8 4   。其 中 的 2例 死 于 大 出血 ， 3 例 为 尿漏 感染 ， 1 例 肠 梗 阻 ， 2例 原 因 不 明 。其 余 的 S D 大鼠存 活( 7 ． 4 ± 0 ． 7 1 ) d ， Wi s t a r 远交 系大 鼠平 均 存 活( 6 ． 9 ±0 ． 6 4 ) d ， 差 别 无 显 著 性 ( P> 0 ． 0 5 ) 。

在 移植 后 3   d 和 7   d ， 在 两组 存 活大 鼠 中均 随机取 移植 肾送 病 理检查 ， 与正 常 肾脏 ( 图 3 ) 相 比 ， 两 组在3   d 时 均 可 见 排 斥 出现 ： 肾脏 组 织 内较 多 的 淋 巴

细 胞浸 润 ， 肾小 管 内有蛋 白尿 出现 ， 肾小 球 内开始 出现 浆液 性渗 出 ， 但 肾小 球 、 肾 小 管结 构 仍 保 持 完 整 ，微 血 管 内未 见 栓 塞 ( 图 4 ) 。第 7 天 时 ， 可见 明显 的排 斥 ， 已有 部分 大 鼠死亡 ： 肾脏 组织 可见 大 量的 淋 巴细胞 浸润 ， 肾小 管扩 张 ， 充 满 蛋 白管 型 ， 肾小 球结 构基 本破 坏 ， 纤 维 化形 成 ， 微 血管 内栓 塞 形成 ， 血管 壁明显增 厚 ( 图 5 ) 。

讨  论

本 移植 模 型 具有 以下 优 点 ： 尽 量在 解 剖 上恢 复移植 肾 的结构 ， 对 移植 肾 的灌注 无 明显影 响 ， 有利 于移植 肾功 能 的保 持 。膀 胱 瓣 吻 合 不 易 产 生 尿漏 、 输尿管 梗 阻等并 发症 。本 手 术需 有一 定显 微外 科基 础者训 练 3 0 ~4 0 对 大 鼠后 ， 可 熟 练 掌 握 ， 一 位 试 验 者即可 胜 任 ， 与 其 他 方 法 相 比 ， 移 植 成 功 率 较 为 满意 [1-9] 。在掌握 基本 的手 术操 作技 巧后 ， 我 们 建立 的模 型可 靠稳 定 。

准 备供 肾 时 ， 肾周尽 量带 少许 脂肪 ， 以便 游 离 肾血管 和吻 合时 牵 拉 ， 减 少供 肾 损 伤 。游 离 受 体 肾脏时 ， 可在 包 膜 下 游离 ， 以减 少 出 血 。游 离 血 管 时 ， 应当从 根部 开始 ， 因为此处 较 远端 容易 分离 ， 且 根部 游离后 ， 若 远端 出血 ， 可 以迅 速夹 闭修 补 。尽量 锐性 分离 ， 以减 少暴 力牵 拉 ， 避 免静 脉 破 裂 出血 ， 也 可 有 效避 免动 脉痉 挛 和外 膜 损 伤 。在 预 备 作 吻 合 的 位 置 ，血管一 定 要分 离光 洁 ， 否则 吻合 困难 ， 而 且 ， 也容 易把 外膜 和脂肪 带入 腔 内引起 血栓 。其 余部 分 的血管不 必 过度 分离 ， 能 完全 阻断血 流 即可 。

在供 肾 冲洗 时 ， 灌 注 速 度 不 能 太 快 ， 否 则 灌 洗压力 过大 ， 可 看到供 肾 明显 肿 胀 ， 表 面“ 出汗 ” ， 将 损伤 肾小球 。在预试 验 中 ， 此 类 肾脏血 流恢 复后 ， 肾脏颜 色 即刻均 由 黄 白色变 为 红 色 ， 但 大 约 2   m i n后 即可 看到 肾脏颜 色 变黑 ， 点 片状 淤血 ， 呈 “ 花 斑 肾” ， 包膜 下 出血 ， 肾功能 损 伤 ， 受 体 均 1   d内 死 亡 ， 尸 体 解剖 发现 移植 肾颜 色较 深 ， 肾脏 大 小 较 正常 肾大 出 1 ／3 。 国外 文献[10] 报 道 冲洗压 力 应为 7 0   m mHg 。

不 同品系 的大 鼠 ， 其解剖也 有所不 同 。在 同等体重 下 ， S D大 鼠的动 静 脉 管径 较 粗 大 ， 管 壁 也较 厚 ， 周围的脂肪筋 膜 也较 坚 韧 ， 尤 其 适 合锐 性 分离 。但 是 ，其 肾动 、 静脉往 往紧密贴 近 ， 此处 分 离 困难 。而且 ， 若受体为 S D时 ， 需较 彻底 地分 离 肾动 、 静脉 根 部 ， 否 则难 以完 全阻 断 血 流 。Wi s t a r 大 鼠 的动 、 静 脉 壁很 薄 ，管径较小 ， 周围脂肪 筋膜也脆 弱 ， 但 是动 、 静 脉 间开 口往往有一 定距 离 ， 因此 ， 若 受体 为 Wi s t a r 时 ， 肾动 、 静脉根部 无需过 多分 离 ， 也可 完 全 阻断 血 流 ， 但 是受 体血管要 斜行剪 断 ， 以期 口径 和供 体相仿 。

保 留 的受 体 和供 体 的动 、 静 脉 均 不 能 太 长 ， 否则 ， 虽 然有 利于 吻 合 ， 但 开 放 血 流后 ， 将 减慢 血 流 速度 ， 影 响供 肾 的灌 注 ， 增 加 血栓 形 成 的机 会 ， 更 重 要的是 ， 过长 的血 管很 容易 蜷 曲 ， 使 吻合 口不 能保 持适度 的张力 ， 血管 壁不 能充 分 张开 ， 即使 是少 许 的渗血也 难 以 自动停 止 。

缝合 动 静 脉 时 ， 应 当将 肾脏 沿 纵轴 翻转 显 示背侧 ， 而不 采用 直接 旋 转 动 、 静 脉 1 8 0 。 的 方 法 ， 因为 旋转容 易造 成两 边 吻 合不 对 称 ， 使 吻合 口血 流 不 畅 且易漏 血 。缝合 静 脉 时 ， 可将 已经 穿 出 的缝 线 拎 起 显露对 侧静 脉 壁 ， 必 要 时 可 用 水 冲 洗看 清 管 腔 以免 缝到 对侧 。一 侧缝 合 完 毕 和对 侧 缝 线 打 结 时 ， 不 要 打结 至静 脉壁 ， 为 以后调 整静 脉 腔 留有余 地 ， 也 不 易引起 管腔 狭 窄 。

受 体 采用 全 身麻醉 ， 全 身血管 会 有一 定 的扩张 ，而且 ， 受体 的手 术 时间也 较 长 ， 为 7 0 ～8 0   m i n ， 术 中腹腔暴 露 于空气 中 ， 有较 多 的体 液丢 失 ， 切 除 的左 肾也有 约 占全 身 1 ／ 8的血 液 ， 因此 ， 即使术 中无 明显 出血 ， 受 体 的血容 量 也 会 不 足 。 以往 文 献 报 道 需 要 补液 ， 多提 及 在 术 后 再 进 行 补 充 [ 1 ] 。在 我 们 预 试 验时 ， 在 吻合好 肾动静 脉开放 后 ， 可见 移植 肾迅 速 变得红 润 ， 趋 于 正常 ， 但 是 在 约 2   mi n 后 即逐 渐 变 白 ， 持续 数分 钟后 再逐 渐 变 红 ， 但 是 再 也 不 能恢 复 到 刚开放 时样 灌 注 良好 ， 呈 花 斑 样 肾 。这 种 现 象 是 受 体血容量不 足 ， 移植 肾灌 注压 不 足所致 ， 会 引起 移植 肾缺血再 灌注 损伤 ， 不 利 于 移 植 肾 的 功能 恢 复 。经 过 我们多 次试 验 ， 发现 在吻 合 肾动脉后 ， 即通过 阴茎背静 脉 补液 5   m L ， 开 放血 流 后 ， 可 保 持 移 植 肾一 直 维 持灌 注 良好 ， 颜 色红 润 ， 尿 液 出现 。也有 文献 报道受 体术 中进 行皮 下补 液 的方 法 ， 采用 生理盐 水 0 ． 1   m L ／ g体 重 的方 法[ 4 ] 。

关 于麻 醉 ， 有 多 种 麻 醉方 式 ， 如 吸入 麻 醉 ， 氯 胺酮 等药 物皮 下或腹 腔 注射 ， 文献 [ 12]  报 道 各 种 不 同麻醉 药物 的使 用对 移植 成 功 率 ， 移 植 物 预 后 均无 明显影 响 ， 使 用戊 巴比妥钠 麻醉 有麻 醉方 便 ， 效 果满 意便于操作 ， 能较 好控 制麻 醉 时间 的优点 ， 但 需要 准确控制 麻 醉剂量 ， 过量 易导 致麻 醉过 深 。

关 于 供受 体 肝 素 化 ， 国 外有 供 受 体完 全 不 用抗凝 剂 的报道 [ 1 3] ， 我 们 的体会 是供 受 体 术前 均 需 要 一定 的肝素 化 ， 否 则 开放 血 流 后 移 植 肾易 形 成 “ 花 斑样” 肾 ， 尤其 当开放 检 查 吻合 口渗 血 时 需 要 补针 ， 更进一 步加 重血栓 形成 。有 文 献[ 4.14]   报道 过 度肝 素 化会导 致受 体假 性动 脉 瘤 的 形成 ， 建议 一般 不 要 超 过3   I U／ g 体 重 。

此外 ， 术 后注 意保 温 ， 术 后 使 用 抗 生 素 ， 注 意 加强 营养 ， 这些 问题 都 要 十 分 注 意 ， 对 促 进 大 鼠恢 复 ，提 高 存 活 率 非 常 重 要 。我 们 参 照 国 外 文 献 采 用1 0 0   w 灯 泡距 离 0 ． 5   m 照 射 1   h [ 15]  。我 们使 用 了青霉 素钠 注射 液效果 明显 ， 能 明显 减少 腹腔 感染 ， 移植肾感染 以及 伤 口感染 的发 生率 。

关 于受 体对 侧 肾切除 ， 根据 研究 目的不 同 ， 对侧肾脏 处理可 以采 取保 留或 者切 除 的形式 。切 除可分为一 期切 除和 二期 切 除 ， 虽 然 二期 切 除 不 需 要 移植肾 即时发挥 肾脏 功 能 ， 但 是需要 接 受二 次手术 ， 其 整体死 亡率 并未 下降 ， 且 无 法 准 确 了解 移 植 肾存 活 情况 ， 根 据 我们经 验 ， 只要 灌洗 良好 ， 吻合 通畅 ， 补 液即时充 分 ， 一期切 除 简单方 便 ， 避 免再 次 打 击 ， 便 于观察研 究 。

S D大 鼠属 于远交 系 品种 ， 关 于 S D大 鼠间移 植会 否产 生急性 排 斥 反应 仍 是 一 个 存 在争 议 的 问题 。L o p e z — N e b l i n a 等[ 1 6 ] 发 现 ， S D 大 鼠 间 肾移 植 未见 急性 肾排 斥反 应 ( A R ) ， 认 为 S D大 鼠之 间 主要 组 织相容性抗 原 ( MHC ) 差 异 很 小 ， 不 适 合 A R模 型 ， 本 研究结果 显示 S D大 鼠之 间 肾移植会 出现严 重 的 AR ，给予 环孢 素 能 改 善 其 病 理 变 化 ， 但 其 肾 小 管 ， 肾 小球 ， 微 血 管损害 较 不 同 品系 之 间移 植 ( S D - - ~ Wi s t a r )为轻 ， 这 同 C h u r c h i l l 等[ 1 7 ] 的观 察结果 一致 。