摘要妇科恶性肿瘤患者外周血中存在着循环D N A，其含量明显高于健康人水平且具有与肿瘤原发灶相一致的基因异常改变，D N A基因启动子甲基化是基因异常中一项重要的表观遗传学改变，是导致肿瘤抑癌基因、D N A错配修复基因、转移抑制基因等表达沉默的重要分子生物学基础。目前已检测到妇科恶性肿瘤患者外周血循环D N A中有多种基因存在异常甲基化．且与肿瘤患者的临床病理特征存在不同程度的相关性。这使得非创伤性早期诊断肿瘤、及时发现肿瘤的复发或转移、监测疗效、预测预后成为可能。

    关键词 循环D N A 甲基化 妇科肿瘤 诊断预后

    妇科恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的疾病，早期诊断是一个重要环节，临床上传统的肿瘤标志物在特异性和灵敏度上均不十分令人满意。人们一直在寻找一种简便无创的检测方法，对妇科肿瘤进行有效检测并评价其进展、分期、治疗效果及预后。D N A甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，是表观遗传学(E p i g e n e t i c s)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及肿瘤发生中起着重要作用，D N A甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。随着微量D N A定性和定量检测技术的飞速发展，血中循环D N A的甲基化检测作为分子生物学研究的一个新兴领域日益受到人们的关注。目前已在多种妇科恶性肿瘤外周血中检测到循环D N A甲基化，为肿

瘤标志物检测提供了新的手段。

1血中循环D N A甲基化

    循环D N A(c i r c u l a t i n g D N A)又称游离D N A(c e l l—f r e e D N A)是一种存在于动植物和人的体液中的无细胞状态的胞外D N A。目前已在血浆、血清、尿液、前列腺液、支气管灌洗液、唾液、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、腹腔液及粪便中检测到了循环D N A。关于恶性肿瘤循环D N A的来源及其发生机制尚无定论，有几种假说：1)增殖旺盛的肿瘤细胞持续释放D N A人血液循环；2)肿瘤细胞坏死或凋亡；3)循环血或微转移灶中肿瘤细胞溶解和肿瘤侵袭周围细胞、组织变形而释放D N A人血；4)肿瘤患者血中存在D N A酶抑制剂，抑制血浆D N A降解，从而使D N A在血中富集¨]。血浆和血清中游离核酸标记物的改变包括基因突变、微卫星改变、基因重排和表观遗传学改变，如异常启动子甲基化、杂合性丢失等，在肿瘤演进中存在随机的、个体化的特点，难以找到共同的、适用于所有或同类肿瘤的标志物，而异常甲基化在肿瘤中属于普遍现象，已成近年来研究的热点。D N A甲基化是指在D N A甲基转移酶(D N A m e t h y h r a n s f e r a s e，D N M T)的作用下，以s一腺苷一L一甲硫氨酸(s—a d e n o—s v l—L—m e t h i o n i n e，S A M)为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶的5位碳原子上，生成5一甲基胞嘧啶(5一m e t h—v l c y t O S i n e，5 m C)口]。D N A甲基化状态的变化与正常胚胎发育、生长等有关，而基因异常甲基化与多种肿瘤的发生和发展密切相关]。

2血中循环D N A甲基化与恶性肿瘤

    研究发现肿瘤细胞中存在异常D N A甲基化状态：基因组整体低甲基化、遗传不稳定性增加，组织特异性基因启动子区域出现从头甲基化，癌基因多为低甲基化导致重新开放或异常表达，抑癌基因多为过度甲基化从而表达受抑。有报道显示>5 0％肿瘤患者存在循环D N A的改变，这使其成为一种普遍的、有意义的临床和流行病学研究的分子标记物。由于游离D N A可在疾病诊断之前就被检测出来，大大增加了其作为检测癌症复发工具的可能性。L o t i o n等通过基因芯片等方法从结直肠癌组织中筛选出一批候选的D N A甲基化分子标记物，并用患者血浆标本进行验证发现神经生长因子受体(N G—F R)、胞裂蛋白9(S E P T 9)等基因甲基化可作为结直肠癌分子诊断的新型标记物。V a n d e r等研究腺瘤样结肠息肉易感基因(A P C)、抑癌基因R a s相关区域家族1 A(R A S S F 1 A)和雌激素受体基因(E S R 1)在8 0例乳腺癌患者外周血游离D N A甲基化情况时发现，乳腺癌患者血中总循环D N A的量明显高于正常人，且5 3％乳腺癌患者外周血发现了一个或多个基因存在异常甲基化。

3血中循环D N A甲基化与妇科恶性肿瘤

3．1循环D N A甲基化与卵巢癌

    近年的研究表明，D N A异常甲基化与卵巢癌的发生有密切的关系，卵巢癌中因启动子低甲基化而表达上调的基因多是细胞增殖、D N A修复、血管生成和细胞迁移相关的基因，如环氧合酶2(C O X一2)、范可尼贫血基因F(F A N C F)、紧密连接蛋白一4(C L D N 4)、尿素酶型纤溶酶原激活物(u P A)、乙酰肝素酶(H P A)和多药耐药基因1(M D R 1)等。而因启动子过甲基化而表达减少的则多是细胞周期调控、细胞粘附、促细胞凋亡、抗细胞增殖和D N A错配修复相关的基因，这些基因包括抑癌基因p 1 4、p 1 6、R A S S F 1 A、死亡相关蛋白激酶(D A P K)等n。I b a n e z等n用M S P法检测卵巢癌患者血浆D N A，结果显示6 8％患者存在遗传性乳腺癌和卵巢癌的易感基因B R C A 1，该基因和R A S S F 1 A基因至少有一个处于过甲基化状态，对余下的患者再检测A P C、D A P K、p 1 4和p 1 6基因发现全部病例至少有一个显示甲基化阳性，即联合检测这6种基因的甲基化状态可使卵巢癌诊断的敏感性达到1 0 0％。而正常对照组女性外周血D N A中此6种基因全部甲基化阴性，即诊断的特异性也是1 0 0％。马琳等。j应用M S P方法检测发现5 1例(4 3．1％)卵巢癌患者的血浆中存在R A S S F I A基因甲基化，正常健康人和卵巢良性肿瘤患者该基因甲基化的发生率均为0。临床分期越晚、病理分化越差的患者血浆中R A S S F 1 A基因甲基化率越高且预后不良。R A S S F 1 A基因甲基化在卵巢癌的发生和发展过程中起重要作用。K a m a t等h叫采用实时定量P C R方法检测卵巢癌患者血浆游离D N A含量也发现Ⅲ／Ⅳ期患者血浆游离D N A含量明显升高，且与对照组相比差异性具有统计学意义，提示血浆游离D N A含量可能成为一种非侵人性的筛查卵巢癌并且评故病情的有效手段。无论是D N A甲基化状态的定性分析还是D N A含量的定量检测在卵巢癌诊断中的应用都具有非常广阔的前景。

3．2循环D N A甲基化与宫颈癌

    宫颈癌是全球妇女第2位常见恶性肿瘤，5年生存率在1 5％～8 0％之间，严重威胁女性健康。人乳头瘤病毒(h u m a n p a p i l l o m a v i r u s，H P V)感染是宫颈癌的重要原因之一，随着病毒D N A整合到人基因组中，肿瘤不断进展，2 0 0 3年的两项研究表明早期宫颈癌患者血清H P V D N A阳性提示预后较差，可作为疾病复发的监测指标。P o r n t h a n a k a s e m等¨纠研究发现5 0例H P V阳性宫颈癌患者中有6例(1 2％)血浆检出H P VD N A，且与组织中检出的H P V类型相同，而在正常对照者及H P V阴性的宫颈癌患者血浆中均未检出。H P V D N A阳性患者H P V D N A总量是未发生转移的患者3倍多，且在完成治疗后一年内发生远处转移的可能性比血浆H P V D N A阴性患者明显增高。Wi d—s c h w e n d t e r等研究9 3例宫颈癌患者和1 9例健康对照者组织和血浆中5种基因启动子甲基化，发现8 7％宫颈癌患者血浆存在不同程度甲基化，若在血浆中检测到基因启动子甲基化则几乎在相对应的宫颈癌组织中均有相同的基因改变。研究n发现，宫颈癌患者血浆C D H 1／C D H 1 3未发生甲基化组无瘤生存期明显长于甲基化组，前者的中位无瘤生存期为4-3年，而后者仅为1．2年。任晨春等n研究宫颈癌患者血浆E一钙黏素基因启动子区甲基化状态发现，随着临床分期和组织学分级的增加，E～钙黏素基因甲基化的检出率也在逐渐增加。

3_3循环D N A甲基化与子宫内膜癌

    子宫内膜癌在女性恶性肿瘤中占第7位，全世界每年有1 8 9 0 0 0例新发病例和4 5 0 0 0例死于该病。目前尚缺乏大量子宫内膜癌患者外周血循环D N A甲基化证据。D o b r z y c k a等n研究发现在I型子宫内膜癌患者中血浆游离D N A的存在与分级相关，而与临床分期无关。在早期的Ⅱ型子宫内膜浆液性癌患者中容易检出低水平的循环D N A。由于Ⅱ型子宫内膜浆液性癌患者多为老年女性，疾病为进展性的且易早期转移，肿瘤的浸润伴随蛋白酶水平的升高，损伤细胞表面结合蛋白，最终导致细胞D N A的释放，大量的脱落D N A进入血液。循环D N A可能成为Ⅱ型子宫内膜浆液性癌诊断的独立生物学标记物，为子宫内膜癌的诊断及组织分型提供了一种新的检测手段。朱介之等n。采用M S P方法对亚硫酸氢盐修饰过的3 5例子宫内膜癌组织、癌旁组织及患者自身外周血白细胞D N A甲基化情况研究发现：1)患者自身非癌组织与癌组织的甲基化具有一致性；脆性组氨酸三联体(F H I T)基因启动子甲基化的出现与发病年龄和体内的雌激素水平及肿瘤进展无关，是内膜癌发生的早期独立于雌激素的表观遗传事件；2)癌旁组织和外周血中F H I T基因甲基化的出现代表了一种癌前的分子水平的变化，尤其外周血白细胞中该基因甲基化的出现代表了正常体细胞的表观遗传学改变，在子宫内膜癌出现以前患者体细胞中已有了该基因的变化。

    血清／血浆中高水平游离循环D N A的存在提示预后不良，在卵巢癌、子宫内膜癌及宫颈癌放疗后，血浆游离D N A浓度明显下降，说明治疗后血浆循环D N A浓度的下降与临床症状的改善如肿瘤负荷的减小和病痛的减轻有关。而对治疗无反应的患者血浆游离D N A浓度持续高水平或没有变化，生存期明显短于治疗后游离D N A浓度迅速下降者，其质或量的改变均可反映肿瘤的存在和严重程度。

4前景与展望

    人体液循环D N A作为一种核酸，突破了通常体液中被检测分析的微量蛋白质、脂肪及糖类等有机大分子无法在人体外被扩增的限制，因而显著地提高了肿瘤转移及复发方面的监测和对肿瘤微小残留病灶诊断的敏感性。循环D N A甲基化的分析对肿瘤早期诊断、治疗、术后监测及预后判断具有重要的指导意义：1)较影像学诊断方法更优越，具有无创、早期诊断的优点，敏感性高，能查出更微小的病灶；2)可用于肿瘤高危人群的筛查，检测出无症状的临床前期肿瘤；3)有助于治疗前对肿瘤恶性程度、临床分期等情况的全面了解，对预后有更准确的判断，从而指导治疗；4)作为临床前期肿瘤复发和转移的监测因子。

    由于血液采集、分离、保存方式和样本选择的不同，循环D N A提取、纯化和定量方法的差异，各研究问缺乏可比性。血液样品的处理过程会直接影响到循环核酸的水平，进而影响研究的准确性和可靠性。目前关于健康人血液循环D N A水平和正常参考值范围，尚未见大样本的研究报道。循环D N A与恶性肿瘤的早发现、早诊断、判断预后的灵敏度和特异度是否超越目前的一些常用的“金标准”还有待检验。