【摘要】基因芯片技术是指将大量基因片段或寡核苷酸进行有序的高密度排列于玻璃、硅等固相支持物上，并通过各种检测手段对探针上的信号强弱进行检测并分析，最终获得样品中大量基因序列及其表达信息的一种技术。基因芯片技术因其高亲和力、高精确性、高信息量等优点在临床疾病的研究中起到了重要作用。对基因芯片技术在眼科领域中的应用进行综述。

    【关键词】基因芯片；生物芯片；眼科；生物检测技术；人类；动物

    基因芯片技术是一项新兴的生物学辅助技术，随着人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的诞生而逐渐发展成熟。基因芯片技术具有检测快速高效、微型化与自动化等特点，因此被广泛应用于生物科技领域。近年来，基因芯片技术在眼科学领域也得到了较为广泛的应用，成为眼科学基础研究与临床研究的重要辅助手段之一。就基因芯片在眼科学研究领域

中的应用进行综述。

1基因芯片概述

    基因芯片(gene chip)也称为DNA芯片(DNAchip)、生物芯片(biochip)、DNA微阵列(microarray)。基因芯片的原理是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地固定排列在支持物(纤维素、硝酸纤维素、尼龙、硅片、金片、载玻片等)上，然后按照碱基互补配对原则和印迹杂交技术与靶基因进行杂交，这些靶基因是从拟研究对象的组织或细胞中提取RNA后进行标记，或将提取出的RNA逆转录成eDNA后进行标记，最后通过激光共焦荧光检测系统对芯片进行扫描，同时应用计算机系统对每个探针上荧光信号的强弱进行检测和比较，从而获得样品中大量基因序列及其表达的相关信息。

    目前关于基因芯片的分类大致可以分为两类：(1)eDNA芯片它是在1995年由Schena等1率先采用自动刻印技术将载玻片作为固相支持物，把双链eDNA或表达序列标签(expressed sequence tag，EST)点于其上。目前这类芯片以cDNA或EST片段为模板，长度在数百至2 000个碱基对，多为PCR的产物。这类芯片的优点是制作较为方便灵活，适用于特殊研究目的但规模不大的研究使用，缺点是在点样时会出现点样不均匀或点样错误2。(2)寡核苷酸芯片这类基因芯片采用光蚀刻技术，用硅片作为固相支持物，是原位合成长约25个碱基对的寡核苷酸，或是将预先合成好的长度60～100个碱基对的寡核苷酸点在载玻

片上。这类芯片由于每个基因都由多个短探针代表，所以可以有效地区分同源性基因序列，提高杂交的特异性和灵敏度。与eDNA芯片相比，寡核苷酸芯片的优点是更适合检测低丰度表达的基因，但由于其在设计和制备的时候都很耗时，且依赖于公共基因序列数据库，所以其探针的制备仍不完善，应用仍不广泛。

2基因芯片在眼科研究领域的应用

2．1基因芯片技术在角膜病方面的研究

    角膜具有结构精细、组织透明、面积小、神经分布密集、对痛觉敏感以及对视力影响较大等特点，所以在角膜病研究时，取材的量就成为影响研究结果的一种限制因素。基因芯片技术的敏感性高，所需要的样本量极少，这就解决了角膜病标本取材“量”的问题。目前，基因芯片技术已经广泛应用于许多角膜病的研究领域，如细菌性角膜炎3、病毒性角膜炎4、创伤性角膜病变5以及角膜内皮营养不良6等疾病的基因表达研究。Yuan等7对白念珠菌感染角膜上皮细胞的小鼠进行标本采集后进行基因芯片分析，在探测的45 102个小鼠基因中，有3 977个基因发生显著改变，其中1 987个基因上调，1 990个基因下调；有1 672个基因

的表达差异达到4倍以上，其中1 075个表达上调，597个表达下调。在这些表达上调的基因中，有超过1／3的基因都参与了白细胞介素．10(interleukin一1，IL-10)的信号通路，而另外一些涉及细胞因子信号蛋白一3的基因表达也上调。该项研究为早期真菌性角膜炎的发

生机制研究提供了分子生物学证据，证实自念珠菌性角膜炎的发病机制可能与上述因子诱导基因的编码相关联，也为治疗真菌性角膜炎(特别是白念珠菌性角膜炎)提供了新方案。

    Ding等8。对长尾黑腭猴的角膜缘、角膜和结膜进行标本采集，之后运用基因芯片的手段进行分析，他们将某种基因的“过度表达”定义为该基因在这种组织中的表达是其他两种组织中表达的两倍以上。实验中发现，在角膜缘组织中有186个基因的转录发生过度

表达，有644个过度表达基因发生于角膜组织标本中，还有506个过度表达基因发生在结膜标本中。在上述的186个基因中，有172个基因编码已知的功能蛋白。这些过度表达的基因主要包括唯同源异型结构域蛋白(homeodomain only protein，HOP)、细胞外因子抑制素．1

(Wnt inhibitory factor．1，WIF．1)、羟基前列腺素脱氢酶(hydroxyprostaglandin dehydrogenase，HPGD)、K1 3、K1 2等。在上述这些因子的表达中，HOP的表达引人关注。HOP是通过心肌细胞的增生和分化来调节心脏功能的一种非典型性同源基因，利用基因芯片技术首次发现了HOP能够在角膜缘上皮细胞的基底层和基质层中呈优势性表达，提示HOP可能参与了角膜缘干细胞的增生和分化。上述因子在角膜缘干细胞上优势性表达的实验有助于提高对角膜缘上皮细胞的分子组成和生物学分化机制的认识。

    Mootha等9。对3例圆锥角膜标本和5例正常角膜标本进行基因芯片分析，结果显示在54 000个测试基因中，有3 900个基因在两组标本中的表达差异有统计学意义，其中在圆锥角膜组，乙醇脱氢酶1类B多肽(alcohol dehydrogenase classI beta polypeptide，ADHlB)、乙醇脱氢酶1类1多肽(ADHlC)、乙醇脱氢酶3类)(多肽(ADH5)的表达明显下降；ADHlB在

圆锥角膜纤维母细胞上的mRNA水平表达下降超过212倍，而它在正常角膜组中的表达并未发生明显改变。这项研究证实ADHlB是圆锥角膜纤维母细胞中转录水平表达降低最为显著的因子。鉴于酶在多种生化代谢路径中所起到的重要作用，可以推测乙醇脱氢酶的缺失或许是圆锥角膜发生潜在的中介物质。

    Wang等10将小鼠的角膜进行烟曲霉菌感染后进行标本采集，并对该标本进行基因表达谱分析后发现，在芯片点样分布的20 868个基因中，有18 169个基因符合标准，这其中有61个上调基因，48个下调基因，这些基因中包括IL．3、基质金属蛋白酶一24(matrixmetalloproteinase一24，MMP一24)、基因MMP-4等。在这些基因表达变化中发现，多糖结合配体能够接合到某些上皮细胞与病原体结合的分子上，并且能够启动与之相关的细胞非特异性免疫反应，且其上调达到3．49倍。此研究结果提示，多糖结合配体可能参与了真菌性角膜炎的病理反应过程。

    另外，Cao等11。研究发现，对小鼠进行准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractivekeratectomy，PRK)术后18～22 h，用基因芯片技术分析该小鼠的角膜标本，发现在分析的1 176个基因中，有37个基因上调，主要包括细胞间黏附分子．1(intercellular adhesionmolecule．1，ICAM一1)、细胞信号蛋白抑制基因等；有27个下调基因，包括连接蛋白一31、缝隙连接蛋白、Smad一2等。这项研究提示角膜上皮的形成和修复与上述基因的表达相关，这对加深认识屈光手术后角膜愈合过程的分子机制提供了实验依据。

2．2基因芯片在青光眼方面的研究

    Wang等12引对采集的青光眼小鼠视网膜标本中视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)进行了基因芯片检测，发现有905个基因的表达发生显著性差异，其中表达上调的基因330个，表达下调的基因575个。这项研究结果提示，在小鼠眼压升高的应答机制中有多种细胞信号通路参与RGCs的病变过程，其中有涉及细胞凋亡的通路，如细胞凋亡蛋白酶通路和Fas通路，而14-3—3通路、磷脂酰肌醇-3一羟基酶(phosphatidyl inositol一3 kinase，P13K)通路表达下调；在涉及促存活细胞信号通路中，JAK／STAT通路的表达显著增加，而JAK／STAT通路是内源性神经保护通路的激活因素之一，所以内源性神经保护通路机制的激活也与JAK／STAT路径相关，这也间接说明基因表达的改变可能是导致青光眼促生存基因和促死亡基因之间平衡改变的重要因素，提示促生存基因表达的减少很有可能是导致青光眼RGCs死亡的重要分子生物学机制。

    Guo等13收集高眼压模型小鼠的视网膜标本，采用基因芯片技术分别检测了小鼠的视网膜全层和RGCs，发现在视网膜全层标本中有632个基因发生显著性改变，其中335个表达上调，297个表达下调，涉及9个表达上调的生物学过程和3个表达下调的生物学过程。在RGCs层标本中，有3 726个基因发生显著性表达差异，其中2 003个表达上调，1 723个表达下调，这些基因中有60％同样出现在视网膜全层的标本中，并且同时发现了13个显著性表达上调和11个表达下调的生物学过程。该实验提示RGCs能够对眼压升高产生更精确的反应，这对减轻高眼压所导致的RGCs损害发挥作用。

    由于青光眼的发病机制与小梁网的结构和正常功能有密切联系，故运用基因芯片技术分析小梁网的基因表达也为青光眼的发病机制提供了依据。Luna等14对人类小梁网细胞的基因芯片检测结果进行分析，探讨了由循环机械应力(cyclic mechanical stress，CMS)诱导的microRNAs(miRNAs)表达的改变，并且检测了miR一24在人类小梁网细胞应对CMS中可能发挥的作用。研究发现，由miR。24表达所诱导的CMS可以导致类似枯草杆菌蛋白酶的蛋白原转化酶FURIN的表达下调，而FURIN已知在转化生长因子一B。(transforming growth factor—Bl，TGF—B】)的生物学进程中扮演主要的作用；miR．24的过度表达导致活性TGF—p。显著减少，而miR-24表达的抑制可以导致TGF—B。少量增加，但这些增加已经足以表明其与miR一24表达的抑制相关。人小梁网细胞中被CMS诱导的活化TGF-B，的增加也可以被miR．24所阻断。先前的研究已经证实CMS可能使小梁网细胞功能发生改变，包括TGF—B。表达上调，这也有可能是青光眼发病的机制之一。综上所述，这项研究的结果显示miRNA有助于调控人类小梁网细胞对CMS的反应，因此miR一24可能在CMS诱导的TGF．B，的表达中扮演关键性作用。这些实验结果为青光眼发病机制分子水平层而的研究提供了依据。

    Wang等15在对9例人类青光眼患者的小梁网组织进行基因芯片技术检测后发现，有141个基因表达上调超过2倍，211个基因表达下调，其中血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A，SAA2)基因表达达到3．2倍。在该研究中，为了证实SAA(主要是其亚型SAA2)在青光眼的发病机制中扮演的角色，再次使用基因芯片技术进行检测，发现有200个基因的表达改变达2倍以上，其中上调基因169个，下调基因31个，在这些上调基因中IL．8的上调表达达到22倍以上，这说明IL．8在SAA(主要是SAA2)的表达中具有重要的调节作用，而SAA对于青光眼患者小梁网结构改变和眼压增高产生作用，因此，IL．8可能是引起人类青光眼和眼压升高的相关基因。Wirtz等16对培养的人小梁网细胞进行基因检测，发现小梁网细胞中表达最丰富的基因包括真核翻译延长因子．1d、纤维连接蛋白等，并将这些表达差异基因与相应染色体定位进行研究，有助于发现青光眼发病的其他基因机制。Zhao等17对人类小梁网细胞加入TGF—B体外培养后使用基因芯片技术进行分析，发现人小梁网细胞的基因表达出现显著改变，在加入TGF-B，的实验组中上调基因为88个，下调基因为54个；而加入TGF-B：的实验组上调基因为19个，下调基因仅为2个。由于TGF．B能够增加房水

量，其表达的上调可能是引起青光眼发病的重要机制，故上述实验结果对青光眼的发病机制提供了相应的基因学实验依据。

2．3基因芯片在眼底病方面的研究

    赵海霞等18在对健康白兔的双眼进行准分子激光角膜原位磨镶术的过程中，进行负压环吸引兔眼角巩膜缘持续3 min，之后剥离该组白兔的视网膜组织进行基因芯片检测，发现负压吸引3 rain后，即刻差异表达的基因共704个，其中上调基因485个，下调基因219个，在这些基因中与凋亡有关的基因共有6个，其中上调5个，下调1个，上调高表达基因主要为CRYAA、CRYAB、TLR3，下调高表达基因是KRTl8；负压吸引3 min后，7 d差异表达的基因共482个，其中上调基因178个，下调基因304个，与凋亡相关的基因有4个，其中上调高表达基因为CRYAB，下调高表达基因为儿J．BETA和ILlRI；负压吸引3 min后，10 d差异表达基因共402个，其中上调基囚213个，下凋基因189个，与凋亡相关的基因共6个，其中上调高表达基因为CRYAB、CRYBA3、CRYBB2，下调高表达基因为儿J—BETA和ILlRl。从上述研究结果中可以发现，在各组实验标本中与凋亡相关的高表达上调基因中都有CRYAB基因。Khan等19和Whiston等20的研究已证实CRYBA基因的正常表达对维持视网膜正常功能具有重要作用。在Kumarapeli等21的相关报道中也指出，CRYAB有抗凋亡和保护缺血损伤的作用，其表达是良性的，减轻了瞬间高眼压对视网膜的伤害。

    罗岩等22对糖尿病早期的大鼠视网膜血管进行相关基因芯片的检测，发现在检测的1 176个基因中，有明显差异性表达的基因共有136个，其中上调基因90个，下调基因46个。在这些基因中，有72个与凋亡相关的基因，其中15个发生明显差异表达，表达上调13个，表达下调2个。在检测到的136个表达明显差异的基因中，主要涉及与细胞周期、细胞黏附、膜通道蛋白、代谢、转录后调节、应激蛋白、凋亡相关蛋白等方面，这些基因的高表达反映了在糖尿病早期的高糖状态下视网膜血管发生改变是非常广泛的，与上述因素都相关，可能是上述因素的共同作用导致了糖尿病早期视网膜血管的改变。

    陆宏等23为研究原发性开角型青光眼(primaryangle clorure glaucoma，POAG)和高度近视的发病机制，采用基因芯片检测方法检测6个品属中Myoc基因的差异表达，发现Myoc基因在BXD重组近交系(BXDRI)小鼠眼组织中的表达量平均水平为10．83，在不同品系的小鼠眼组织中表达存在差异，其中在B6小鼠中表达量最高，为1 1．43，在BXD55小鼠中表达量最低，为8．39。根据基因表达的数量性状分析，本研究结果显示Myoc及Myoc的基因调控网络可能参与了POAG的发病过程。

3 结语

    基因芯片技术是一种新兴的生物医学研究手段，它已经打破了以往“一种疾病一个基因”的研究模式，能够对采集到的标本信息进行全方位、大容量地分析整合并得出相对准确的结论，该技术在眼科研究中的作用正日益凸显。应用基因芯片技术对眼科疾病的基础研究和临床诊疗都具有很大的帮助，是未来发展前景广阔的研究手段之一。