摘要:缝隙连接是介导相邻细胞间物质转运、化学或电信号传递的专用跨膜通道,维持着细胞内环境的稳定。在神经系统中,缝隙连接不仅介导神经元和胶质细胞的胞间偶合,还参与病理条件下继发性损害。目前,研究证明缝隙连接在由神经系统损伤引起的神经病理性痛中发挥作用。对缝隙连接与神经病理性痛的关系进行研究有助于更深层次的了解神经病理性痛的发病机制,为治疗神经病理性痛提供新的研究方向。

关键词:缝隙连接;连接蛋白;神经系统;胶质细胞;神经病理性痛;缝隙连接阻断剂

　　缝隙连接(gap junction,GJ)最早由Karrer 在1960 年发现。经过许多学者的多年研究,对GJ 的结构和功能已经有了较深的认识。GJ 几乎存在于所有动物的细胞膜上,由每个细胞提供一个半通道(连接子)紧密结合形成相邻细胞间的通讯通道,每个半通道由6 个相同或相似的跨膜连接蛋白呈环状排列构成,中央形成一个直径约1． 5 ~2． 0 nm 的亲水性通道,这是细胞间进行直接交流胞质成分的唯一通讯通道。GJ 的通道允许相对分子质量小于1 ku 的分子通过,如细胞内的无机盐离子、糖、氨基酸、核苷酸、维生素、三磷酸腺苷(ATP)、环磷酸腺苷(cAMP)和肌醇三磷酸(IP3 )等小分子物质能从一个细胞通过GJ 的通道进入另一个细胞,从而实现代谢偶联或电偶联[1] 。GJ 既可以存在于两种相同类型的细胞间,也能连接两种不同类型的细胞。例如,在中枢神经系统中,神经元之间、胶质细胞之间(包括星型胶质细胞之

间、少突胶质细胞之间和星形胶质细胞与少突触细胞之间)[2] 。与中枢神经系统中的GJ 相似,在外周神经系统中,神经元之间和胶质细胞之间也存在GJ。这些细胞通过GJ相互连接形成功能合胞体,在神经冲动信息传递及各种反应过程中,通过调节细胞外离子浓度,神经元与神经胶质细胞间的电活动等作用维持着细胞内环境的稳定和神经元功能的实现[3 -4] 。近年来对于神经胶质细胞与神经元的GJ 研究发现,在神经病理性疼痛模型中上述细胞间的GJ 明显增加,并且相关区域的GJ 蛋白表达也增加,使用GJ 阻断剂后,疼痛有所缓解。这使得许多研究工作者开始将治疗神经病理痛的注意力从神经元转移到胶质细胞之间的GJ 上,这将为后续开发治疗神经病理痛的药物提供一个新靶标。

1　缝隙连接的结构、分布和功能

    1. 1　缝隙连接的结构与分布　缝隙连接是相邻细胞间细胞膜上的一种特殊结构,允许细胞间直接进行物质和信息交换,实现相邻细胞间直接通讯,这种通讯也叫做缝隙连接细胞通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)。缝隙连接通道是由相邻的两个细胞各提供一个连接子(connexon)对接形成,两个连接子之间存在2 ~ 3 nm 的间隙,因而缝隙连接也称间隙连接。每个连接子含6 个跨膜蛋白质亚单位,即缝隙连接蛋白(connexin,Cx)。由相同Cx 组成的连接子称为同聚体连接子,不同的连接子组成异聚体连接子,同聚体连接子参与构成同型缝隙连接,异聚体连接子参与构成异型缝隙连接[1 -2] 。每个Cx 都具有4 个保守的ɑ 螺旋跨膜区(M1 - M4)、2 个胞外环(C1 - C2)和3 个胞内成分(1 个胞内环、1 个氨基末端和1 个羧基末端)。2 个胞外环是Cx 最为保守的结构,每个胞外环含有3 个半胱氨酸残基,保证连接子的正确对接。胞内成分中,N 端相对比较保守,而C 端差异性比较大,携带某些磷酸化节位点。Cx 是由多基因家族编码的一大类膜蛋白,目前已从不同动物和组织中分离出20 余种Cx,它们有近50%的氨基酸序列相同。其对分子质量26 000 ~60 000 不等。Cx 是根据它们的分子质量不同来命名的,如Cx43 因其分子质量为43 ku 而得名[1,3] 。

    研究表明,除了在精母细胞、红细胞、血小板、成人骨骼肌上和某些成年神经元群体没有连接蛋白基因分布外,其他几乎所有的哺乳动物细胞上均有其分布[1] 。在不同的细胞和(或)细胞的不同发育阶段,所表达的Cx 类型及表达的量都有所不同,有些Cx 表达于单一的组织中,而有些组织和细胞同时表达多种类型的Cx。迄今为止,已经确定至少有11种Cx 在哺乳动物的神经系统中表达,Cx26、Cx29、Cx30、Cx31、Cx32、Cx33、Cx36、Cx37Cx40、Cx43、Cx45 均在神经系统中大量表达[3] 。其中神经元上表达的主要是Cx26、Cx32和Cx36,分布尤为广泛的是Cx32;星形胶质细胞和卫星胶质细胞中表达最多、分布最广的是Cx43;而在少突胶质细胞中主要表达Cx32[2] 。近几年神经系统的研究表明,除了神经元外,胶质细胞也在神经病理痛中发挥重要的作用。本篇综述着重于神经系统中的缝隙连接,特别是神经病理疼痛时外周初级感觉神经节和脊髓胶质细胞上的缝隙连接。

1. 2　神经系统中缝隙连接的功能

1. 2. 1　神经元中缝隙连接的作用　中枢和外周神经系统的神经元大部分区域存在缝隙连接,允许神经元之间进行离子交换,是神经元之间的电突触结构,具有单向或双向传递神经冲动的功能。哺乳动物中枢神经系统发育过程中,通常在出生后2 周内,神经元之间的间隙连接偶合和Cx36 的表达会瞬时增加,在神经元发育中起到重要的作用[5] 。神经元损伤后,代谢型谷氨酸受体激活导致神经元间缝隙连接增加,神经元间的缝隙连接参与了神经元死亡机制,但具体机制仍不明确[6] 。GJ 是神经活动同步化的关键因素之一。大脑中许多功能是以GJ 介导的神经活动同步化为基础的,包括认知功能,例如记忆的巩固、感知和学习,海马体中Cx36

组成的缝隙连接通道参与短期记忆,并通过改变神经干细胞的分化参与神经元重构[7 -8] 。此外,神经元之间的GJ 允许第二信使在细胞间流动,保证功能区内的细胞生物效应协调一致。

1. 2. 2　胶质细胞中缝隙连接的作用　在神经系统中,星形胶质细胞间的缝隙连接研究较多,超微结构显示这些GJ 大部分包围着神经元的胞体、树突和轴突。脑类糖原主要贮存在星形胶质细胞中,由于GJ 允许小分子代谢物和信号分子通过,由GJ 实现细胞间的偶联,保证正常的生命活动。研究证明,神经冲动时,神经元中大量的K+ 外流,此时星形胶质细胞K+ 通道激活,K+ 大量流入星形胶质细胞内,并迅速通过GJ 运送到相邻细胞内,达到清除细胞外K+ ,维持神经元外环境K+ 的稳态的功能,保证神经元电活动的正常进行[9] 。神经损伤后,诱发脊髓中星形胶质细胞K+ 通道关闭,导致其缝隙连接蛋白功能中断,从而诱发神经性疼痛[10] 。此外,星形胶质细胞间的GJ 是胶质细胞长距离信号传播的生物基础。胶质细胞受刺激后,细胞内的Ca2 + 浓度发生改变,通过GJ 使其它偶联的胶质细胞内的Ca2 + 浓度也发生改变,即形成Ca2 + 波(calcium wave) 。胶质细胞通过Ca2 + 波调节神经系统的功能[11] 。对卫星胶质细胞间的缝隙连接研究发现其功能大部分与脊髓中的星形胶质细胞相似,包括调节外周神经系统的外环境,维持神经元的稳态和功能[12] ,由于对其研究较少,具体的功能还有待进一步的研究确定。

1. 2. 3　神经元与胶质细胞之间缝隙连接的作用　神经元与胶质细胞之间是否存在GJ 一直存在争议。Rash 等[13] 运用免疫细胞化学、电镜等技术发现,在成年大鼠大脑内神经元只与其它神经元存在GJ,与胶质细胞不存在GJ。在体外共同培养神经元与胶质细胞的实验发现胶质细胞内刺激产生的Ca2 + 波能传递到神经元内,使神经元兴奋,且GJ 阻断剂辛醇可减弱这种信号的传递[14] ,此研究提示神经元与胶质细胞间存在GJ。在免疫电镜下观察戊四氮点燃大鼠海马组织发现,神经元与星形胶质细胞之间存在Cx43 构成的半通道[15] ,这与刘煜等对实验性自身免疫性脑脊髓炎豚鼠的研究结果一致。但由于实验技术的局限性,这些结果未完全使人信服,神经元与胶质细胞之间是否存在缝隙连接以及其存在的意义,仍有待进一步的研究探明。

2　缝隙连接与神经病理痛

2. 1　神经病理性痛　国际疼痛研究协会(IASP)将神经病理性疼痛(neuropathic pain)定义为由躯体感觉系统的损伤或疾病而直接引起的疼痛[16] ,包括痛性糖尿病神经系统病变、三叉神经痛、坐骨神经痛和脊髓损伤性疼痛等。神经病理痛,简称神经痛,分为外周性和中枢性两种,属于慢性疼痛。神经痛的发病率较高,最近一项流行病学调查显示其发病率在普通人中已经超过8%。神经病理痛患者感到异常疼痛,常伴有睡眠障碍、焦虑、抑郁、精神萎靡、注意力分散、食欲减退,严重影响病人的生活质量。目前,神经病理痛发病的分子机制仍不够清楚,导致多种因素引发的神经病理痛得不到有效的治疗。近几年发现缝隙连接参与神经病理痛关于这方面的研究仍比较少,从缝隙连接方面来研究神经病理痛的防治,将为神经病理痛的治疗带来一个新的研究方向。

2. 2　缝隙连接与神经病理痛　周围神经损伤可能导致机械和热痛敏,并增强背角神经元的兴奋性。神经损伤后,邻近的神经胶质细胞也可能在脊髓伤害信号的传递中发挥重要作用[17] 。胶质细胞间交流的基本机制是通过缝隙连接,允许第二信号(如环磷酸腺苷、三磷酸肌醇)、离子和小亲水性分子(如ATP)在细胞之间自由通过。大量的研究表明,胶质细胞间的缝隙连接可能在神经病理性疼痛中发挥重要作用[18] 。缝隙连接在神经病理痛中的作用机制见Fig 1[3] 。神经损伤可以诱发感觉神经元和胶质细胞的异常活动而产生疼痛。损伤后,胶质细胞最明显的变化是胶质细胞间缝隙连接数目增加以及对ATP 的敏感性增强。人们普遍认

为,活化的神经胶质细胞诱导中枢敏化并释放一些化学物质,如促炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)加剧疼痛。ATP作用的P2X 受体如小胶质细胞上的P2X7 受体的活化是促炎细胞因子释放的必不可少因素[18] 。最初认为星形胶质细胞和小胶质细胞的活化是对脊髓损伤(spinal cord injury)所造成伤害的一种神经保护性反应,但激活如果一直持续,激活的神经胶质细胞就会发生继发性损害,诱发神经元和胶质细胞死亡,将神经损伤作用蔓延。在外周损伤区域,继发性损伤与ATP 高水平持续释放一致。虽然ATP 的来源仍然有争议,但已证明细胞外高水平的ATP 能激活小胶质细胞和白细胞上的P2X 嘌呤受体,尤其是激活P2X7 受体后可促进宿主细胞因子和促炎分子的分泌(如ROS、IL-1β、IL-6、TNF-α)[19] 。这些细胞因子是脊髓中神经细胞的致敏源,有助于形成神经病理性疼痛[20] 。此外,用药物阻断和基因缺失方法抑制P2X 受体能减轻动物疼痛行为。因此,活化细胞的P2X 受体是神经病理性疼痛形成过程中的一个重要环节。早期的研究显示,脊髓损伤后有大量释放的ATP[19] 。然而,如Cx43 的基因缺失,脊髓损伤后的脊髓星形胶质细胞外ATP 的浓度明显降低。由于缝隙连接通道的结构显示它们有外排高浓度的ATP 的作用,由此认为缝隙连接通道是ATP 释放的重要途径。研究表明嘌呤信号在神经病理性疼痛中发挥重要作用,因此缝隙连接在神经病理性疼痛中的作用需要进一步深入研究。

2. 2. 1　脊髓中缝隙连接与神经病理痛　越来越多的研究表明,脊髓中的胶质细胞,特别是星形胶质细胞中的GJ 可以在各种病理性疼痛病症(包括神经性疼痛) 中发挥重要作用[17,21] 。在病理条件下,一些化合物如神经递质、生长因子、肽和细胞因子的异常释放可影响连接蛋白的表达并影响缝隙连接通道的通透性。研究显示,活化的脊髓星形胶质细胞可能有助于维持背角神经元的过度兴奋,导致在组织和神经损伤后痛觉信息在脊髓中的传递加强[20] 。脊髓损伤后,星形胶质细胞出现的一个显著特征是高表达Cx43。患者化疗引起的神经病变表现为星形胶质细胞活化增多和Cx43 的表达增加。大鼠L5 脊髓神经节结扎(spinal nerve ligation,

SNL)建立的神经病理痛模型实验显示,给SNL 大鼠鞘内注射Cx43 蛋白的siRNA 后能缓解SNL 大鼠的机械性痛觉超敏反应[22] 。神经损伤后,Cx43 的表达迅速上调,引发通过GJ 偶联的细胞内Ca2 + 大量内流,并释放谷氨酸,从而增强神经的敏感受性,导致神经细胞过度兴奋而死亡。发生在脊髓背角内的这些效应有助于形成神经病理痛。此外, Cx43 可密集地分布在参与痛觉传导的脊髓背角胶质细胞内[23] 。由于Cx43 蛋白是星形胶质细胞间缝隙连接的主要连接蛋白,并能够协调胶质细胞网络的同步活动,损伤后Cx43 半通道过度表达和星形胶质细胞间缝隙连接偶合增强,可能影响神经元的活动诱发疼痛。虽然已经明确在神经病理痛条件下脊髓星形胶质细胞中Cx43 表达和功能会发生变化,但对于Cx43 变化的机制仍不清楚。

2. 2. 2　背根神经节中缝隙连接与神经病理痛　哺乳动物的感觉神经节,特别是背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)在传递感觉信号的过程中有重要的作用而受到研究者的关注。

目前已有较多研究证明,感觉神经受损后导致DRG 神经元形态和电活动等发生变化而产生神经病理痛。而DRG 中卫星胶质细胞间的GJ 参与神经病理痛的发生的研究到最近才受到重视。Hanani 等[4] 第一次证明神经损伤可引起外周神经节的一种特殊的胶质细胞- 卫星胶质细胞(satellite glia cells,SGCs)间的GJ 增多。这种外周神经胶质细胞通过缝隙连接通道高度偶合,大部分SGCs 紧密的包绕着感觉神经节神经元的胞体,包绕数量与神经元胞体大小成正比。SGCs 通过缝隙连接成对存在,并且表达嘌呤受体。SGCs 可以释放细胞因子、ATP和其他化学信使,它与星形胶质细胞有许多共同点,包括调节外周神经元的稳态,从而保证神经元的正常活动[24] 。SGCs 主要是通过调控缝隙连接、钾离子通道和卫星胶质细胞摄取细胞外谷氨酸的能力来维持神经元外环境稳态的。SGCs 与外周神经元的信息交流主要通过兴奋性神经递质谷氨酸和ATP 信号通路与嘌呤受体进行的,神经损伤后,这些功能活动紊乱,导致疾病发生[25] 。如神经损伤后SGCs 上的P2X7 受体激活,ATP 信号通路开放,进而调节

DRG 神经元P2X3 受体影响痛觉[24] 。化疗引起的外周神经病变能引发神经病理痛,Warwick 等[26] 用奥沙利铂或紫杉醇等抗癌药物注射至大鼠体内建立神经病理痛模型,结果发现,SGC 的标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein,GFAP)表达增加,SGCs 间的GJ 比正常状态增加了2~5 倍。这与在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis,EAE)大鼠模型中观察到的结果一致[27] 。

    有证据表明,在神经系统受损后,GJ 的增加参与了胶质细胞活化的部分过程(Fig 1)。GJ 的增加实现了DRG 中卫星胶质细胞和神经元之间的远距离连接通讯,并影响神经元的兴奋性和相邻的感觉神经元的自发放电。神经受损后使SCGs 激活,进而释放炎性细胞因子(IL-1β、IL-6 和TNF -α)、一氧化氮和前列腺素等,GFAP 表达上调,这与受损后星形胶质细胞的变化类似[28] 。初级感觉神经节中神经胶质细胞间传输信号的一种方式是形成细胞间钙波,SGCs 和神经元之间这种信号传递是双向的。钙波的传递依赖于偶联的细胞间第二信使(如IP3、ATP)的扩散,而第二信使的扩散需要借助于缝隙连接通道来完成。神经受损后,激发神经元动作电位的改变,诱发神经元释放ATP, ATP 激活神经元以及包绕着神经元的SGCs 上的嘌呤受体,诱发这些细胞内的Ca2 + 浓度增加。Ca2 + 浓度增加诱发SGCs 释放更多的ATP[26] 。受损后间缝隙连接增加,细胞释放的ATP 将能通过缝隙连接通道更多的作用于周围细胞的嘌呤受体,影响Ca2 + 通道的开放,从而调节细胞内外的Ca2 + 浓度,造成更强的钙波在神经节间传播,这将导致初级感觉神经节的神经元过度兴奋,而引发疼痛。另一方面,神经受损后,神经元兴奋性增加,导致细胞外钾离子(K+ )浓度升高,SGCs 间缝隙连接增加是一种

神经元的保护措施,可使K+ 更有效的再分配,起到缓冲作用,不至于激增的K+ 改变细胞外环境,同时能使有害物质远离神经元[9] 。

    近年来,已对Cx43 表达的变化和疼痛之间的关联进行过较为详细的研究。研究表明,损伤能诱导Cx43 蛋白表达的变化,Cx43 介导神经元的敏化作用。研究证明,缺血后Cx43 表达受抑制是一种神经保护方式,神经损伤后Cx43 表达减少能镇痛。有趣的是,减少非损伤大鼠中Cx43 的表达可增加大鼠的疼痛行为[28] ,出现这种情况可能是正常的缝隙连接功能出现紊乱,使其对细胞内K+ 的缓冲能力降低,导致神经元过度兴奋而自发放电。因此,沉默Cx43 的表达对神经受伤的动物具有镇痛作用,而对于正常动物却能诱发早期疼痛。CX43 参与疼痛的机制还需要进一步的研究。

2.3　缝隙连接阻断剂与神经病理痛　随着缝隙连接在神经病理痛中重要作用的发现,研究人员致力于缝隙连接阻断剂对神经病理疼痛治疗作用的研究。目前,用于此研究的胶质细胞间的GJ 阻断剂主要有甘珀酸(carbenoxolone,CBX)、甲氯灭酸( meclofenamic acid, MFA) 和棕榈油酸( palmitoleicacid,PA)等。在内脏痛模型中,注射上述3 种药物后,能阻滞SGCs 和神经元间由于损伤而诱发的病理变化,并可明显地缓解疼痛[20] 。缝隙连接阻断剂中研究最多的是CBX(18-甘草次酸的衍生物),它能消除SGC 和神经元之间由于损伤而引起的缝隙连接偶合,减弱由损伤引起的周围炎性疼痛行为,在持续性疼痛的各种动物模型中产生镇痛作用[20] 。在

SNL 模型建模成功2 ~ 3 周后鞘内注射CBX 可减弱SNL 大鼠的热痛敏反应。电生理方法研究显示,与鞘内药物相似,SNL 大鼠脊髓局部注射CBX 也能减弱神经元对机械刺激和

反复性皮内电刺激的反应。故SNL 模型大鼠鞘内注射CBX对神经病理性疼痛的抑制作用可能涉及缝隙连接通道的抑制,进而减弱背角神经元的电活动[22] 。同样,眶下神经部分切断诱发疼痛和中枢敏化的疼痛模型中,鞘内注射CBX 能影响神经切断引起的机械激活阈值,改变延髓背角中枢敏感参数,这些结果表明,缝隙连接可能与口面部神经性疼痛机制有关[23] 。在对化疗引起神经病理痛的小鼠注射CBX 后,几乎完全阻断SGCs 间的缝隙连接通道,结果观察到染色的42 个SGCs 间的缝隙连接通道中只有一个偶合。同时,注射CBX 后能提高化疗处理小鼠的疼痛阈值,与注射棕榈油酸产生同样的镇痛作用。因此,缝隙连接阻滞剂对化疗引起的神经病理性疼痛具有治疗作用[26] 。

    CBX 是Cx43 缝隙连接和半通道的有效阻断剂,它可结合缝隙连接通道,并诱导其构象发生变化以关闭通道[18] 。研究表明,CBX 还可以阻止其他通道,如脊髓星形胶质细胞与P2X7 受体相关的pan-1 通道[27] 。此外,新近的研究显示,CBX 可以调节突触传递和神经元膜的通透性,并增加神经元中活性氧的形成,通过调节阴离子通道控制星形胶质细胞的体积,抑制小胶质细胞中IL-23 的表达[30] 。CBX 影响疼痛的一种机制可能是通过抑制半通道,进而抑制神经胶质介质(如促炎性细胞因子,ATP 和谷氨酸盐)的释放产生镇痛作用(Fig 1)。尽管CBX 有上述的作用,但由于注射的阻断剂分布至全身,很难确定它们精确的作用位置,对此尚待进一步的研究确定。

3　结语

    综上所述,胶质细胞缝隙连接参与了神经损伤后引起的神经病理痛过程。越来越多的研究表明,阻断背根神经节和脊髓的缝隙连接通讯和半通道开发有助于缓解神经病理疼痛。但目前对缝隙连接在痛觉调制中的作用机制尚未完全清楚,这需要我们对缝隙连接蛋白的调控和功能做更深入的研究,损伤后缝隙连接蛋白.