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HAND2蛋白在先天性巨结肠肠壁肌间神经丛中的表达及意义术
【摘要】 目的研究HAND2蛋白在先天性巨结肠症患儿肠壁肌间神经丛的表达情况,探讨HAND2蛋白与先天性巨结肠发病的关系。方法应用免疫组化二步法染色检测46例先天性巨结肠患儿狭窄段、移行段、扩张段和正常段肠壁组织肌间神经丛中HAND2蛋白的表达,用计算机图像分析软件(Image ProPlus 6.0)计算HAND2蛋白在先天性巨结肠各段肠壁组织肌间神经丛的免疫组化阳性染色的平均光密度值。结果HAND2蛋白在先天性巨结肠患儿正常肠壁组织的肌间神经丛有阳性表达,多呈强阳性;环形肌及纵行肌亦有表达,多呈中等强度阳性。狭窄段肌间神经丛中,未见有阳性染色的神经节细胞,可见肌间神经纤维表达呈弱阳性或阴性;在移行段与扩张段肌间神经丛中,可见较多阳性表达肌间神经节或神经纤维。分别与移行段、扩张段及正常段比较,狭窄段的平均光密度明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论狭窄段肠壁肌间神经丛中HAND2蛋白表达量降低,HAND2蛋白表达改变可能是先天性巨结肠的发病因素之一。
【关键词】 先天性巨结肠;HAND2;免疫组化;肌间神经丛
先天性巨结肠(Hirschspmng S disease,HD)又称无神经节细胞症,是由肠神经系统(enteric nervous sys—tern,ENS)发育异常所致的一种先天性肠道疾病。HD以胃肠道黏膜下和肌问神经丛的神经节细胞的缺失为特征。临床上,根据无神经节细胞肠管长度的不同,可分为短段型、长段型及全结肠型,短段型更为常见。HD的亚洲发病率最高,约为2.8:10 0001。近年来,HD的病因和发病机制的研究主要集中在ENS的发育异常方面。我们前期利用全人类基因组表达谱芯片技术检测出HD差异性表达基因,其中HAND2基因表达下调,并经RT—PCR验证。目前国内HAND2的研究甚少,国外学者多在心脏、肢体发育以及ENS中研究HAND2的作用,很少HAND2与HD的研究报道。本研究从前期研究结果中选取HAND2基因,利用免疫组织化学方法来观察HAND2蛋白在HD肠壁肌间神经丛的表达情况,初步探讨HAND2蛋白在HD中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料收集2009年4月至2012年9月在广东省妇幼保健院i]',JIAb科经手术治疗的患儿手术标本46例,所有患儿术后均经病理证实为HD,手术标本分为狭窄段、移行段、扩张段及正常段组织。其中男39例,女7例,年龄1周至3岁;新生儿8例,1~12个月
33例,l3~23个月5例。短段型34例,长段型7例,全结肠型5例,均为散发病例,无合并其他主要脏器的先天性畸形或综合征。所有患儿家长均签署“知情同意
正常段肌间神经丛平均光密度值分别为5.21±3.38、l7.92±9.79、19.09±15.15和19.92±16.28,与其他肠段比较,狭窄段的平均光密度值明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);移行段与扩张段、移行段与正常段及扩张段与正常段间的平均光密度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
3 讨论
HD是一种常见的小儿先天性消化道畸形,其发病是遗传因素、肠神经系统胚胎发育及肠壁内微环境改变等多种因素的综合作用,而ENS的胚胎发育缺陷是HD发病的重要原因。ENS是神经脊起源的,神经脊的分化及定植受到影响,导致肠道的某一区域缺乏肠神经节细胞,致使HD的发生2。目前HD的研究多集中在其发病机制方面。
我们前期利用全人类基因组表达谱芯片技术筛选出HD 622个表达差异显著的基因,其中584个基因表达下调。我们对包括HAND2在内的可能与HD相关的6个基因进行RT—PCR验证,验证结果显示与基因芯片结果相符。为了进一步证实HAND2蛋白在HD发病中的作用,我们应用免疫组化技术观察HAND2蛋白在HD肌间神经丛的表达情况。HAND2是碱性螺旋一环一螺旋(basic helix—loop—helix,bHLH)转录因子家族的一员3,bHLH蛋白的主要功能为调节各种干细胞向终末细胞的分化,其高表达可促进干细胞的分化,相反低表达则抑制干细胞的分化4。HAND2蛋白在心脏、腮弓、肢体及神经脊起源细胞的发育过程中表达并有重要作用5。
在ENS中,编码HAND2基因的转录子在胃肠道发育的全过程中表达,早期其表达就局限在黏膜下神经丛及肌间神经丛6。HOWARD等7用神经元特异性的p微管蛋白(p—tubulin)作为神经元标记物,结合原位杂交及免疫细胞化学技术发现,在神经脊衍生的神经元中,HAND2的表达主要在肌间及黏膜下神经节。我们采用免疫组化技术发现,HAND2蛋白在HD患儿肠壁的肌间神经丛有阳性表达,环形肌、纵行肌及黏膜下也有表达。LEI等8通过敲除小鼠的HAND2基因,发现ENS中缺乏正常神经节形态特征的肌间神经丛,神经节变得稀疏,其分布比较紊乱,神经纤维的密度增高且排列紊乱,说明HAND2在ENS发育中起到重要作用。我们的HE染色发现,HD患儿病变段肌问神经丛的病理变化与其研究一致。D AUTRI~AUX等9用siRNA沉默肠神经脊起源细胞中的HAND2基因,发现神经元的发育迟缓,肠神经元的终末分化受到影响。通过分析肌问神经丛中HAND2蛋白的表达情况,本研究发现,从狭窄段到正常段肠壁的肌问神经丛中,HAND2蛋白阳性率逐渐增加,强阳性表达的神经丛数目也逐渐增多。狭窄段黄棕色染色的平均光密度明显降低,与移行段、扩张段及正常段比较,其染色的平均光密度值差异有统计学意义(P<0.01)。而移行段与扩张段、移行段与正常段及扩张段与正常段间的平均光密度值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。由于平均光密度值可以反映目标物质的单位面积浓度,此值与目标物质的总量呈正比,可以认为HAND2蛋白的表达量与平均光密度值呈正相关。因此,HD狭
窄段中HAND2蛋白的表达下调。结合前期基因芯片结果,我们推测,狭窄段HAND2基因表达的下调导致其编码蛋白的表达下调,影响神经脊细胞的分化及定植,从而对ENS的发育产生影响,与HD的发病关系密切,可能是导致HD发病的因素之一。
本研究在前期工作的基础上从蛋白水平证实了HAND2蛋白的表达下调,可能与HD发病密切相关。但HAND2在基因调控中的作用如何,其在NES中缺失或者表达下降的机制,还有待于进一步的研究证实。