神经束植入及甲钴胺治疗失神经骨骼肌的实验研究

【摘要】目的研究神经束植入治疗失神经支配骨骼肌，探讨神经营养药物应用的最佳给药方法。方法选用雄性大鼠制作左侧胫神经切断动物模型。A组：神经束植入组；B组：神经束植入+左侧腓肠肌注射甲钴胺；C组：神经束植入+腹腔注射甲钴胺；D组：胫神经切断；E组：胫神经切断+左侧腓肠肌注射生理盐水。术后当日开始，B组隔日左侧腓肠肌注射甲钴胺300“g／l(g，C组隔日腹腔注射甲钴胺300嵋／kg，E组隔日左侧腓肠肌注射等渗盐水0．02 ml。分别于术后4周和8周测量小腿三头肌肌肉湿重、肌纤维横截面积和Bcl一2蛋白抗体免疫组化染色。结果术后4周及8周，A、B、C三组间小腿三头肌肌肉湿重、肌纤维横截面积和Bcl一2蛋白抗体免疫组化染色比较差异均有统计学意义(P．05)；A、B、C组与D、E组差异有统计学意义(P．05)。D组与E组之间差异无统计学意义(P>0．05)。B组明显优于其他组。结论神经束植入术能有效防治失神经骨骼肌萎缩，靶肌肉给药效果优于全身用药。

【关键词】周围神经；失神经骨骼肌；神经束植入；靶器官；投药

    周围神经损伤导致其所支配的骨骼肌萎缩，如何促进其最大限度地恢复功能，一直是神经修复的基础和临床研究的热点。神经束植人术作为周围神经损伤修复的方法之一，国内外学者进行了一系列的研究1-2。本研究采用成年大鼠制造动物模型，观察神经束植人术治疗去神经支配的骨骼肌的疗效，并探讨全身和靶器官局部应用甲钴胺的情况，为临床寻找和评价神经束植入术的疗效及神经营养药物应用的最佳给药方法提供理论依据。

l材料与方法

1．1材料试验动物：采用同月龄体重27¨00 g

的成年健康雄性SD大鼠60只(广东省医学动物实验中

心提供)；主要实验试剂：Bcl一2蛋白免疫组化试剂盒

(兔抗鼠多克隆抗体，美国Santa Cmz生物公司)；甲钴

胺注射液(日本卫材株式会社，规格500 pg／m1)。

1．2实验方法

1．2．1实验分组将60只SD大鼠随机分为五组，每组12只，分别于术后4周和术后8周各取6只进行检测。A组：神经束植入组；B组：神经束植入+靶肌肉注射甲钴；c组：神经束植入+腹腔注射甲钴胺；D组：胫神经切断；E组：胫神经切断+靶肌肉注射生理盐水。

1．2．2动物模型制备3-4应用lo％水合氯醛溶液(375 mg^唔)腹腔内注射麻醉大鼠成功后，将大鼠固定于俯卧位，选左后肢为实验侧。常规脱毛、消毒，做大鼠左后肢股后外侧纵切口，钝性分离并牵开股二头肌内、外侧头后，暴露坐骨神经下段胫神经起始处。在放大1 0倍的手术显微镜下解剖出坐骨神经及胫神经、腓总神经。在胫神经及其腓肠肌分支人肌肉处锐

性切断。将A、B、c组大鼠胫神经断端沿束间锐性分离，分别以9~o无创显微缝合线放射状植入于腓肠肌内，植入部位在原胫神经腓肠肌分支周围，植入后将周围肌肉缝合于胫神经近端外膜上，包埋神经干固定，闭合切口，术后不固定。D组和E组按照上述方法切断神经后将近端翻转l 800后，固定于股二头肌肌膜上，阻止神经间自然生长。术后当日开始，B组隔日左侧腓肠肌注射甲钴胺300¨g／kg，C组隔日腹腔注射甲钴胺300斗g／】(g，E组隔日左侧腓肠肌注射生理盐水0．02 ml，A组和D组不做任何处理。术后大鼠分笼常规饲养，切口均愈合良好。

1．2．3观察方法

1．2．3．1大体观察术后大鼠左后肢皮肤营养情况及肌肉萎缩情况。于术后第4周、第8周取材时观察肌肉丰满程度、颜色及弹性。

1．2．3．2测量大鼠小腿三头肌湿重将大鼠麻醉后取左后肢纵切口，近端至膝关节上2 cm，远端至跟骨结节。全层切开皮肤、皮下组织、深筋膜，显露肌腹确认小腿三头肌后，于放大10倍手术显微镜下，将左小腿三头肌自起止点处切断，完整地取下左侧小腿三头肌后测定其湿重。

1．2．3．3测量大鼠左小腿三头肌肌纤维横截面积取腓肠肌中份肌肉，沿肌纤维方向切成条状，固定后石蜡包埋，做厚5“m横向切片，HE染色。切片用自动图像分析系统进行图像分析，测定肌纤维横截面积取均值。

1．2．3．4 Bcl一2蛋白抗体免疫组化染色图像分析采用彩色病理图文分析系统，根据染色的灰度确定同一标准，测定染色阳性的肌细胞平均光密度值。

1．3统计学方法使用SPssl7．0统计学软件对各组大鼠左侧腓肠肌电位波幅及Bcl一2蛋白抗体免疫组化染色测定光密度值，数据用均数士标准差国曲表示，进行单因素方差分析及齐性检验，方差齐后再做组间分析，组间比较采用SNK叼(Snldent-N『cwm距．Keuls)检验。

2结果

2．1大体观察各组动物均成活至实验结束，术后2周各组动物左后肢跛行明显，2周后A、B、c组跛行逐渐减轻、消失，D、E组跛行持续存在，各组均未出现实验侧足趾溃疡。术后4周及8周各组左侧腓肠肌均有不同程度肌肉萎缩，颜色白，弹性减退，其中B、c组较轻，A组中等，D、E组最为明显。

2．2小腿三头肌湿重术后4周和术后8周，左小腿三头肌湿重A、B、C三组均高于D、E组，其中A、B、C组间差异均有统计学意义(P．05)，D、E组间差异无统计学意义(P>O．05)，A、B、C组与D、E组差异有统计学意义俨．05)，见表l。

2．3肌纤维横截面积测定术后4周及8周，左小腿三头肌肌纤维横截面积A、B、C组均高于D、E组，其中A、B、c组间差异均有统计学意义(P<0．05)，D、E组间差异无统计学意义(P>O．05)，A、B、C组与D、E组差异有统计学意义(P．05)，见表2。组别只数4周时肌纤维横截面积8周时肌纤维横截面积

2．4 Bcl一2蛋白抗体免疫组化染色Bc卜2蛋白表达阳性细胞细胞浆呈棕黄色，肌肉萎缩时Bcl一2表达减少，术后各组中Bcl一2蛋白阳性细胞均有不同程度表达，术后4周和8周Bcl一2蛋白表达A、B、C组均高于D、E组，其中A、B、C组间差异均有统计学意义(P<0．05)，D、E组间差异无统计学意义(P>O．05)，A、B、C组与D、E组差异有统计学意义(P．05)，见表3。

3讨论

周围神经损伤后所支配的骨骼肌因神经营养作用丧失及废用而发生萎缩，并出现一系列形态结构、生理生化及代谢功能等方面改变。目前神经修复包括外科和组织工程方面的修复。其中神经修复的显微外科手术包括神经松解术、神经缝合术、神经移植术、神经移位术和神经束植人骨骼肌术等。

神经束植入术作为周围神经损伤修复的方法之一，国内外学者进行了一系列的研究。Papalia等1对大鼠应用神经端侧缝合与神经植入相结合的方法，即将大鼠腓神经切断后，其远端以端侧缝合法缝合到完整的胫神经干上，再将腓神经的终末支直接植入到胫前肌内，证明胫前肌获得了良好的神经再支配。王江宁等2通过大鼠骨骼肌异位移植寄养后运动神经植

入促进神经再生的作用研究，证实运动神经植入能有效防止或减轻异位移植寄养的骨骼肌失神经性萎缩，有助于恢复神经、肌肉的部分功能。国内有学者进行神经束植入皮下组织修复转移皮瓣感觉5-8血管神经束植入组织工程骨后有明显的骨化作用【9】。本实验拟通过采用神经束植入失神经支配骨骼肌，观察靶肌肉的肌萎缩、肌细胞凋亡情况从而验证神经束植入治疗失神经支配骨骼肌是否有效；同时进一步比较全身及靶肌肉应用神经营养药物的疗效。

3．1失神经支配骨骼肌萎缩失神经支配骨骼肌因神经营养作用丧失及废用而发生萎缩，并出现一系列形态结构、生理生化及代谢功能等方面改变【10】。徐建广㈣研究认为，肌肉湿重、肌细胞直径及截面积可作为反映肌肉萎缩的组织形态学指标，而后两者更为可靠；骨骼肌失神经支配后，肌细胞直径及截面积随失神经支配时间延长呈进行性下降。因此，本研究采用肌湿重、肌纤维横截面积衡量骨骼肌萎缩的指标。通过本研究发现A、B、C组在术后第4周、第8周肌肉湿重、肌细胞直径及横截面积方面均优于D、E两组。结果证实，神经束植入失神经支配的骨骼肌后可明显减少骨骼肌萎缩。

3．2失神经支配骨骼肌细胞凋亡研究还发现失神经支配骨骼肌细胞出现凋亡12-13，证实在正常的骨骼肌细胞中没有见到呈阳性反应的凋亡细胞核，而失神经支配的骨骼肌细胞中出现有凋亡特征的细胞核，且随着失神经时间的延长，凋亡的细胞核数逐渐上升。田涛等12用流式细胞仪在对凋亡相关基因蛋白表达研究时发现在周围神经损伤引起的骨骼肌萎缩中伴有Bcl一2基因的表达减少，亦即是肌肉萎缩越明显时BcI一2表达减少就越明显。本实验在术后第4周和第8周采用Bcl一2蛋白抗体免疫组化染色法对试验侧失神经骨骼肌染色，采用彩色病理图文分析系统对染色阳性的肌细胞平均光密度值测定，发现行神经束植入及给予甲钴胺的A、B、c组均高于对照组D组和E组。以上结果显示神经束植入可有效减少失骨

骼肌萎缩时肌细胞凋亡的发生。

3．3不同途径给予甲钴胺对失神经支配骨骼肌萎缩的影响甲钴胺治疗周围神经损伤在临床上已广泛应用，本实验研究选用了甲钴胺注射剂以便于不同的给药途径的操作。在用药量方面，卢耀军等14噪用以大鼠为受体的实验结果表明，靶肌肉注射甲钻胺可有效治疗周围神经损伤，较高的剂量(300}lg／kg)能发挥较好的作用，并认为局部注射甲钴胺可以对靶肌肉发挥局部营养作用，从而有效防止靶肌肉的萎缩。本实验以大鼠为受体，比较腹腔注射和靶肌肉局部注射给药的不同方式给予甲钴胺对失神经支配骨骼肌萎缩的影响，发现B组在术后第4周、第8周肌肉湿重、肌细胞直径及横截面积和Bcl一2蛋白抗体免疫组化染色方面均优于C、E两组，结果证实靶肌肉注射甲钴胺的效果优于腹腔注射。推测原因系靶肌肉射甲钴胺除一部分被吸收入血液，同时靶肌肉局部短时间内必然也有一部分未被吸收而滞留在局部，大大提高了局部组织中甲钴胺的浓度，从而有效发挥其防止肌肉萎缩的作用，其具体机制尚需进一步研究。

    综上所述，神经束能有效防治失神经骨骼肌萎缩及肌细胞凋亡；靶肌肉注射甲钴胺效果优于经腹腔注射给药。