内脏神经一体神经端侧吻合后神经再生方式的研究

【摘要】目的通过内脏神经一体神经端侧吻合建立人工体神经一内脏神经反射弧大鼠模型2 5只，荧光双标追踪技术研究神经再生方式。方法在成活的2 1只模型鼠左侧盆神经节(M P G)内注射0．5 I x 1荧光金(F G)，腰4前根(L 4 V R)的外周神经一坐骨神经注射1快蓝(F B)进行逆行神经追踪。应用组织化学方法对吻合口远端的神经根(kV R)进行甲苯胺蓝染色。结果逆行追踪结果显示F G单标和F G—F B双标神经元主要分布于脊髓L左侧前角，F B单标神经元主要分布于脊髓L 1～左侧前角。脊髓腰4节段每张切片上F G单标神经元、F B单标神经元、F G—F B双标神经元数目分别为(2 0．8±3．3)、(5．7 4-1．3)、(1 0．3±0．7)。吻合口远端(L 6 V R)再生的神经经甲苯胺蓝染色后可见轴突呈深蓝色。结论逆行追踪结果证明内脏神经一体神经端侧吻合建立人工体神经一内脏神经反射弧后，体神经可以通过侧枝发芽的方式长入并替代内脏神经。

【关键词】端侧吻合；神经再生；体神经；内脏神经

1 9 9 2年V i t e r b o等报道体神经与体神经端侧吻合后可诱使未受损的神经干发出侧芽长入受损神经干的远端。L u n d b o r g等、N o a h等和S c h m i d h a m me r等…通过组织形态学和生理学检查证实体神经与体神经端侧吻合后存在神经再生。我们通过内脏神经一体神经端侧吻合建立人工体神经．内脏神经反射弧大鼠模型，利用荧光双标追踪技术探讨内脏神经．体神经端侧吻合后神经能否再生及再生的方式。

材料与方法

1．动物分组与模型建立：3 0只S P F级成年雄性S p r a g u e—D a w l e y大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，体质量2 0 0～2 5 0 g。被随机分为模型组(／Z=2 5)和正常对照组(n=5)。动物模型建立：腹腔注射1 0％水合氯醛麻醉后，俯卧位，背部正中切口，显露并咬除L一棘突和左侧椎板，打开硬脊膜，在椎管内分离出左侧L 4前根(L 4 V R)和I J 6前根(L V R)，在L V R进入椎间孔水平斜行离断L V R，将kV R的外周段缠绕在L 4 V R上约2．5周，然后把V R的尾端用1 0 4)可吸收缝线吻合在L V R上，使神经紧密对合，依次关闭切口。对照组大鼠不作任何处理。模型组和正常对照组大鼠在温暖(2 0～2 4℃)，湿度5 0％～6 0％，光暗周期为1 2 h的安静环境中饲养。

2．材料制备：模型大鼠建立4个月后，存活2 1只，1 0％水合氯醛麻醉，在左侧盆神经节(M P G)微量注射4％荧光金(F G，美国B i o t i u m公司)0．5 l，存活2 d后，在左侧L V R的外周神经(坐骨神经)微量注射3％快蓝(F B，P o l y s c i e n c e s公司)1 l，再存活3 d，然后

将大鼠灌注固定，开胸经左心室至升主动脉插管，先用1 0 0 m l生理盐水快速冲洗血液，再用含4％多聚甲醛的0．1 m o l／L磷酸盐缓冲液(P B S，p H 7．4，4 o C)5 0 0 m l先快后慢灌注固定。取脊髓L～s节段，模型大鼠同时取L V R距吻合口远端一段1 0 m m长的神经，浸于上述相同的固定液内4℃后固定4 h，脊髓组织入3 0％蔗糖溶液4℃过夜，待组织完全沉底后，恒冷箱冰冻切片机切片，甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察F G及F B标记神经元在脊髓中的分布。神经根从固定液中取出经脱水后石蜡包埋，横断面切片行1％甲苯胺蓝(美国S i g m a公司)染色。组织切片厚度：脊髓冰冻切片2 0 m厚，神经根石蜡切片5 m厚。对照组大鼠的神经追踪、取材及后续处理同模型组大鼠。

3．显微镜观察：从每个模型鼠脊髓腰4节段间断选取5个切面并计数荧光标记神经元数目。光镜下观察甲苯胺蓝染色的再生轴突。

结果

1．大体观察：模型大鼠灌注固定后，腰背部正中切口，小心切开剥除脊髓外面的各层组织，充分游离吻合口处的神经，可见左侧I J 6 V R与L V R吻合口处神经紧密缠绕在一起。

2．普通光镜观察：模型大鼠吻合口远端L V R神经根经甲苯胺蓝染色后，光镜观察见再生轴突数量较多，有髓神经纤维排列整齐密集。

3．模型大鼠F G、F B标记神经元在脊髓中的分布：将F G和F B分别注入模型大鼠左侧M P G和左侧坐骨神经，逆行追踪结果显示，F G单标神经元、F G-F B双神经元主要分布于脊髓L左侧前角，F B单标神经元主要分布于脊髓L～I J 6左侧前角。脊髓腰4节段每张切片上F G单标神经元、F B单标神经元、F G—F B双标神经元数目分别为(2 0．8±3．3)、(5．7±1．3)、(1 0．3±0．7)。标记神经元多为类圆形或椭圆形的多极神经元。

4．正常大鼠F G、F B标记神经元在脊髓中的分布：正常大鼠逆行追踪结果显示，F G标记神经元多分布于脊髓L和s节段左侧骶副交感核(S e N)区域，标记神经元为三角形。F B单标神经元主要分布于脊髓～L 6左侧前角，标记神经元多为类圆形。

讨论

我们以前的研究证明了体神经和内脏神经端端吻合后，体神经可以再生替代内脏神经，并且新形成的人工体神经一内脏神经反射弧传出神经元的递质主是乙酰胆碱，体神经和内脏神经吻合后再生神经主要递质没有改变。

F G和F B荧光双标追踪结果显示在模型大鼠脊髓L 4前角可见F G、F B单标及F G—F B双标神经元。在脊髓L 4节段有F G．F B双标神经元，证明了内脏神经与体神经端侧吻合后，体神经通过侧支发芽的方式长出侧支进入内脏神经；F G单标神经元的出现，说明部分再生神经源于吻合口处供体神经轴突的直接再生。同时光镜下观察到了吻合口远段神经内有再生的轴突。本研究从形态学初步证实了内脏神经和体神经端侧吻合后，体神经可以长入并替代内脏神经。它为通过内脏神经和体神经端侧吻合建立人工体神经．内脏神经反射弧，从而修复内脏器官功能提供了形态学依据。