神经干细胞移植对脑挫伤大鼠神经功能恢复神经元存活和轴突再生的影响

【摘要】目的观察神经干细胞(N S C s)移植对脑挫伤大鼠神经功能恢复影响，并探讨其机制。方法2 4只s D大鼠以投币法分为3组：假手术组、手术组和N S C s移植组。采用自由落体致大鼠皮质运动区脑损伤模型，将培养纯化并鉴定的N S C s于术后当天移植入损伤位点周围；术后0 d、3 d、7 d、1 4 d行神经功能缺失(N S S)评分，观察动物运动和平衡功能缺损与恢复情况；1 4 d时取脑组织用免疫荧光技术检测h o e h e s t标记的移植N S C s在体内存活、迁移；用神经元核蛋白(N e u N)、生长相关蛋白(G A P 4 3)抗体检测并计数宿主神经元存活和局部轴突再生。结果与假手术组比较，脑外伤组大鼠脑挫伤后即出现不同程度抽搐，瘫痪，平衡功能缺失。神经功能缺损评分较假手术组明显升高，并随时间推移有所降低。而N S C移植组的N S S评分至第7天后与单纯手术组比较有明显减少[(4．3 8±0．7 4)分，(5．5 0±1．0 7)分，P<0．0 1]。H o—c h e s t标记的移植N S C s能在宿主脑组织存活，并向四周迁移。免疫组化染色显示宿主N e u N阳性神经元[(5 1．4 6±3．3 0 3)个，(4 2．8 3±5．4 0 1)个，P<0．0 1]和G A P-4 3阳性纤维数量[(1 3．3±1．7)个，(8．7±1．1)个，尸<0．0 1]在N S C移植组明显增多。结论N S C s移植能在挫伤脑组织存活、迁移，并促进宿主神经元存活、局部轴突再生和改善脑挫伤大鼠神经功能。

【关键词】脑挫伤；神经干细胞移植；神经功能评价；神经元存活；轴突再生

脑外伤(T B I)在临床非常常见，其中严重的脑外伤是致残，甚至致死的重要因素。脑外伤后常有神经细胞凋亡、坏死，并伴有许多空泡状液化腔隙形成。后期护理虽然重要，但所致功能缺陷改善常常不够理想。细胞或者组织移植治疗为取代受损部位损失的细胞，恢复功能形成带来了机会。神经干细胞(N S C s)是存在于中枢神经系统，具有自我更新和多种分化潜能的始祖细胞。在一定条件下，N S C s能保持增殖能力，并能向神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞分字、王健、王廷华、章为)，过去的研究已报道，脑挫伤后移植神经干细胞能部分改善大鼠神经功能，但其作用机制仍不十分清楚，并且N S C s移植是否存进脑挫伤大鼠损伤部位神经元数目和轴突生长表达的文献并不全面。本研究建立脑挫伤模型并立即移植N S C s，通过计数各组N e—u N阳性细胞数，比较各组宿主神经元存活情况，同时检测G A P-4 3阳性纤维数量，从支持神经元存活和协助轴突再生的角度探讨N S C s移植促进神经功能恢复。

材料与方法

一、材料s D成年健康雌性大鼠2 4只，由四川大学实验动物中心提供，体质量2 2 0 g左右，通过投币随机分组法将大鼠分为假手术组：只切开头皮和凿开颅骨；手术组：切开头皮和凿开颅骨后，用自由落体冲击脑组织造成中度脑外伤；N S C s移植组：造成中度脑外伤后给予N S C s移植。每组8只大鼠。

二、方法

1．神经干细胞培养：取孕E 1 2～1 4 d大鼠，3．6％水合氯醛麻醉后放入7 5％酒精中浸泡消毒约1～2 m i n，然后将其仰卧位放于玻璃培养皿中，剖开腹腔取出子宫内的胎鼠，放于盛有细胞培养的玻璃培养皿中(置冰袋上以防止组织降解)。用解剖镊剥离出胎鼠，取下头部放于另一盛有细胞培养专用P B S液的玻璃培养皿，在剖显微镜下剥离头皮及颅骨，钝性游离胚胎脑组织，剥离大脑表面脑膜，去除大脑表层皮质，暴露深部海马。用显微镊分离并取下海马组织，放入含2 0 n g／m l b F G F和2 0 n g／m l的D M E M／F I 2培养基中，用移液枪反复吹打，机械分离组织制成细胞悬液。

以2．5～5×1 0个／m l细胞密度接种到六孑L培养板中，放入3 7℃、5％C O培养箱中培育。隔日半量换液，原代培养周期为7 d，以后传2～3代纯化。观察N S C s的形态变化。

2．神经干细胞鉴定：取培养的2～3代细胞悬液，离心5 m i n(1 0 0 0 r p m／m i n)收集细胞。取部分细胞加入经过滤的4％多聚甲醛，4℃固定3 0 m i n，再离心5 m i n，去除多聚甲醛并收集细胞，用P B S液漂洗并离心2～3次去除多聚甲醛，收集细胞加入冻存托物盘上用O T C预冷制备的细胞冻存井，置一2 0 c【=冰冻切片机中冻存约3 0 r a i n；贴片法收集细胞切片，5 5～6 0℃烤箱烘干细胞切片用N e s t i n抗体(1：1 0 0，兔多克隆抗体，C h e m i c o n)按s P两步法进行免疫组化染色，D A B棕色反应显色，常规脱水、透明封片后在显微镜下观察N e s t i n阳性反应部位。根据染色是否为阳性鉴定神经干胞。

3．脑挫伤模型制备：采用F e e n e y l】法通过自由落体撞击来制作脑外伤模型。用3．6％水合氯醛(1 m l／1 0 0 g)行腹腔注射麻醉。麻醉后，将大鼠俯卧位固定，常规消毒铺巾，在距头颅前囟5 m m处冠状切开皮肤成“u”型切口，将头皮向尾侧翻开。分离骨膜，暴露右

侧顶骨，于矢状缝旁开2．5 m i l l，冠状缝后1．5 m m钻一骨孔，咬除颅骨直至骨窗扩大为直径5．0 m l T l×5．0 m m，显露硬脑膜，以5 0 g重的铁质圆柱体自3 0 c m高处沿铁杆自由落体撞击垫片，造成右侧大脑运动皮质区挫裂伤。

4．免疫抑制剂使用及细胞移植：所有实验动物移植前3 d开始用环孢素注射液(诺华制药5 m l／2 5 0 m g)，按每天每只老鼠2 0 0 g体质量注射1 m g环孢素直至取材。大鼠脑挫伤后立即移植N S C s(细胞悬液浓度为5×1 0／1)。具体方法为：将大鼠固定于立体定位架上，在距创伤灶中心周围头侧、尾侧、左、右3 m m的四各点分别用自制玻璃微针，在立体定位仪上进行细胞移植。推针速度为1~z l／m i n，注射后停针5 m i n。

5．神经功能缺损评分：分别于损伤后0 d、3 d、7 d、1 4 d用双盲法参照C h e n等¨报道的神经功能缺损评分(N e u r o l o g i c a l S e v e r i t y S c o r e s，N S S)方法，进行脑神经功能缺损评分。

6．样本获取：取术后1 4 d各组脑组织，常规多聚甲醛左心室灌注固定，取脑组织入4％多聚甲醛4 c c后固定过夜。切片前分别人1 5％、3 0％蔗糖过夜沉底，在大脑皮质以创伤为中心取5 m m见方正方形块，可保留少许白质，在冰冻切片机上作冠状连续切片，片厚2 0 I x m。

7．宿主脑组织形态学及植入细胞存活，迁移检测：用H E染色显示脑组织形态。在荧光显微镜下，观察植人神经干细胞在宿主脑组织存活，迁移情况。

8．免疫荧光组织化学染色：用2 0％正常羊血清(N H S)切片2 h；加入抗鼠N e u N(1：5 0 0，C h e m i c o n)和G A P-4 3(1：1 0 0 0，C h e m i c o n)I抗(用0．0 1 m o l／L P B S和3 0％T r i t o n稀释I抗，并加入N H S原液使N H S的终浓度为2％)；将切片于4℃冰箱缓慢反应2 4 h；P B S T(0．0 1 m o l／L P B S和3 0％T r i t o n的混合物)漂洗1 5 r a i n；分别加人兔抗鼠4 8 8绿色荧光Ⅱ抗(1：2 5 0，C h e m i．c o n)，用锡箔纸于室温下使其避光反应2 h；裱片晾干。荧光显微镜用相应激发光下观察，照相。每个样本选取5张切片，每个切片随机选取5个4 0 0倍视野，计数宿主脑损伤组织N e u N阳性细胞数及G A P-4 3阳性轴突数。

9．统计学方法：以上实验所得数据根据数据特征选择相应的统计方法，用S P S S 1 7．0统计分析软件处理数据，所得实验数据用均数±标准差表示，P<0．0 5表示差异有统计学意义。

结果

一、体外培养N S C s的形态学与鉴定原代培养细胞在无血清的b F G F培养基中生长1～2 d后开始形成大量不规则的悬浮生长的细胞团，细胞数量几个到十几个不等。在随后的2～3 d可见悬浮细胞分裂生长成更多细胞的小细胞团。到3～5 d时生长成为有几十个至数百个细胞克隆球，呈圆形，大小不一。这些悬浮生长的克隆球，形态规则，折光性较好。克隆球经n e s t i n免疫组化染色鉴定证实为神经干细胞。

二、大鼠的神经功能缺失评分结果大鼠给予自由落体撞击伤后，行为学观察显示：脑损伤大鼠活跃程度明显降低，N S 评分中感觉功能和反射功能各组中都未未观察到明显变化，故没有做统计。有变化的神经功能缺损评分改变主要集在运动功能和平衡木试验。各组大部分大鼠伤后当天发生抽搐，瘫痪不能正常行走。平衡木实验发现，脑损伤大鼠四肢与躯于失去平衡功能，容易跌落，评分明显较假手术组大鼠升高(P<0．0 1)。而N S C s移植组的神经运动行为学评分与手术组比较7 d后有明显下降，差异有统计学意义(P<0．O 1)，但1 4 d时仍未达到假手术组水平。说明N S C s移植导致损伤大鼠神经功能部分恢复，但仍不能达到正常水平。在运动功能评价中，各组大鼠术后运动功能都有缺损，并随时间推移有一定恢复。其中，N S C移植组的神经行为学评分从7 d后开始明显下降，显示出明显改善。见表1～3。

三、宿主脑损伤组织形态学1 4 d组时，假手术组神经元及胶质细胞形态结构正常，几乎未见明显肿胀的细胞和炎性细胞浸润现象。而脑损伤组可见创伤灶中心为无结构的坏死区，周围细胞水肿明显和组织间隙增宽，创伤灶及周围水肿区可见较多细胞核固缩、深染、细胞膜完整的凋亡神经细胞，也可见许多呈空泡状的细胞，为液化坏死的神经细胞，同时可见有明显炎症细胞浸润受伤部位和周围的神经元及胶质细胞肿胀，神经元的周围可见有空隙，还可见胞核浓缩、深染，而且7 d时表现最为明显。移植组可见坏死区及周围水肿区范围较对照组明显缩小，周围水肿减轻，凋亡细胞减少，炎症细胞浸润较少。

四、N e u N及G A P 4 3染色免疫荧光染色显示，假手术组脑神经元形态结构正常，胞体突起清晰。脑损伤组创伤灶周围N e u N阳性细胞数明显较假手术组减少。而N S C移植组N e u N阳性细胞数有明显增多[(5 1．4 6±3．3 0 3)，(4 2．8 3±5．4 0 1)，P<0．0 1]。在正常脑组织也能见到少量G A P-4 3阳性纤维。脑损伤周围组创G A P-4 3染色纤维数较假手术组有所增多，但差异无统计学意义。而N S C移植组较损伤组呈现了更多的G A P-4 3染色纤维[(1 3．3±1．7)个，(8．7±1．1)个，P<0．0 1]，差异有统计学意义。

本实验探讨了N S C s移植促进脑挫伤大鼠神经功能恢复的机制。发现N S C s移植促进脑挫伤大鼠脑神经元存活和轴突再生。说明N S C s移植发挥脑保护作用可能与支持宿主神经元存活，促进局部神经再生有关。本实验模型中，脑损伤后动物出现抽搐，不能直线行走，说明脑功能严重受伤，证明脑挫伤模型建立成功。然而，随着时间推移，N S S评分有所降低，至7 d有统计学意义。说明脑损伤后脑功能有一定自主恢复。

而运动功能先于平衡功能恢复，推测平衡功能除运动功能外还与精细触觉和小脑投射联系相关，恢复较运动功能慢。

本实验结果显示，脑损伤大鼠四肢与躯干的平衡和运动功能明显受损。而N S C s组的神经运动行为学评分从7 d后开始明显下降，表明N S C s移植能有效进脑损伤大鼠脑功能恢复。而这种效果发生在N S C s移植后1周。由于通过n e s t i n染色，证实所移植物为N S C s。且已报道脑挫伤后移植神经干细胞在宿主体内能分化成为神经元和少突胶质细胞。，故本研究没有再检测植入N S C s的分化。在本实验中，观察到在脑损伤周围组织有阳性标记的N S C s，并向四周迁移。说明移植N S C的确能在损伤脑组织周围存活。这可能是N S C s移植促进脑损伤神经功能恢复的细胞学基础。

免疫荧光染色显示，脑损伤组创伤灶周围N e u N阳性细胞数明显较假手术组减少。说明创伤导致一些脑细胞死亡。由于N S C s移植组N e u N阳性细胞数明显增多，提示N S C移植可能对宿主皮质神经元有保护作用。此外，N S C s移植组还呈现了更多的G A P-4 3染

色纤维，说明N S C s还有利于宿主局部轴突再生。G A P-4 3是当轴突受到损伤后，轴突延长和重建过程中表达的标志分子，是评估轴突损伤和再生反应的重要指标，在神经纤维的生长、发育、轴突再生以及突触功能的维持等方面起着重要作用，G A P 4 3在移植组增加，说明移植N S C s在损伤脑中有促进神经元轴突再生的作用。关于N S C s促进宿主神经元和轴突再生的可能分子机制有以下几点：N S C能分泌C N T F，V E G F等多种细胞因子，进而支持宿主神经元存活，减少其凋亡研究表明，运用C N T F对损伤脊髓神经元存活有明

显的保护作用¨。V E G F可以减轻脑损伤后血管内皮细胞的凋亡和坏死，维持血管内皮结构的稳定，促进血管内皮细胞的增殖，重新形成新的微血管，刺激内皮细胞分泌一氧化氮，增加血流量来改善微循环等。综上，N S C s移植对脑损伤大鼠神经功能呈现了积极的保护作用，其机制可能与分泌细胞因子，促进宿主神经元存活，增加局部轴突再生数量有关，为临床研究N S C s移植提供了可靠的实验数据。