摘要以蓝斑背肛海兔(N o t a r c u s l e a c h i i c i l T O S l 1．S S t i m p s o n，N L C S)的口腔神经节(B u e e a l g a n g l i o n，B G)为研究对象，按B G形态对称性，解剖成亚B G(s u b—B G，S B G)，并分为左S B G和右S B G，简称为L S B G和R S B G．用双向凝胶电泳(2 D—P A G E)技术优化分离L S B G和R S B G全蛋白质，并采用蛋白质组学和数据库比对技术筛选与鉴定差异蛋白质．实验结果表明，L S B G和R S B G之间的差异蛋白质主要由活性多肽的前体蛋白或降解后大片段多肽组成，它们对维持B G的生理功能起着重要的作用．在急性镉盐(1 O g／m L)胁迫下，N L C S的L sB G和R S B G表达了由镉盐诱导的差异蛋白质，并采用蛋白质组学技术分别分离、筛选和鉴定，其主要的差异蛋白质有下调的肌球蛋白、钙结合蛋白、上调的热休克蛋白和硫氧还蛋白．这些蛋白质可能与B G细胞抗镉毒性有关，部分差异蛋白质适合于监测镉盐污染且开展毒理学研究的蛋白指示物．

    关键词海兔；亚口腔神经节；蛋白质组学；镉盐；蛋白指示物

    海兔(A p l y s i a)是海洋中常见的雌雄同体动物¨J，其中枢神经系统(C N S)主要由口腔神经节(B u c—c a l G a n g l i o n，B G)、大脑神经节(C e r e b r a l G a n g l i o n，C G)和腹部神经节(A b d o m i n a l G a n g l i o n，A G)等组成，但N L C S的C N S却缺少A G 3．4 J．海兔B G细胞直径位于1 0 0～2 0 0 m之间J，B c是如何行使其控制口腔及其附属器官活动；如何调控海兔的摄食活动和海兔之间的信息交流等一直是神经科学家关注且亟待解决的问题之一．海兔吸引素是一种由5 8个氨基酸残基组成的水溶性多肽，主要来源于海兔卵腺(E g g c o r d o n s)，并作为海兔之问进行信息传递与交流的物质之一l】J．然而，识别和降解吸引素的生理功能是否与海兔B G有关尚不清楚．H u m m o n等发现海兔B G中含有酸性多肽(A c i d i c p e pt i d e，A P)内切酶．我们以A P为探针结合M A L D I—T O F质谱分析技术发现海兔C G中含有超微量L—L或L—K多肽内切酶．通过优化分离N L C S的B G全蛋白，并应用肽质量指纹(P e p t i d e m a s s f i n g e r p r i n t i n g，P M F)图谱和数据库比对技术鉴定了9 6个蛋白质_，但多数蛋白质的生理功能至今尚不清楚．本文在前期研究基础上，将N L C S的B G进一步分为L S B G和R S B G，并用蛋白质组学技术分离与鉴定L S B G和R S B G之间差异蛋白质．在模拟镉盐胁迫环境下，分离筛选和鉴定L S B G和E S B G分别受镉盐诱导前后的差异蛋白质，为后续连续监测流动海水中镉盐污染程度及其危害性提供蛋白指示物．

1实验部分

1．1仪器与试剂

       R E F L E X m型M A L D I—T O F质谱仪(德国B r u k e r公司)；超速冷冻离心机(B e c k m a n公司，美国)；真空浓缩离心机(L a b c o n c o)；I n v e s t i g a t o r H T D a t a b a s e图像分析软件(G e n o m i c S o l u t i o n s)．

    载体两性电解质(A m e r s h a m公司)，p H=5～8；胰蛋白酶购白P r o m e g a公司；一氰4一羟肉桂酸(H C C A)购白美国I C N生物医学公司；S D S分子量标准购自F e r m e n t a s公司；二硫苏糖醇(D T F)、超纯尿素(u r e a)、过硫酸铵(A P S)、硫脲、诺乃洗涤剂(N o n i d e t P-4 0，N P-4 0)、3[(3一胆酰胺丙基)一二乙胺]一丙璜酸(C H A P S)均购置于上海生工集团．

1．2海兔亚口腔神经节分离

    N L C S捕获于厦门市内海浅滩区域．每只N L C S净重在8 O～2 0 0 g之间，采集后置于1 4℃海水培养箱内，人工养殖数天．取3 0只N L C S置于l 4℃海水中，按每只N L C S体重注入等体积的氯化镁溶液(2 8 m m o l／L)于体内．待N L C S组织软化后，迅速在解剖镜下分离B G，并用蒸馏水清除B G表面盐分和杂质．参考B G对称性形态结构，选用微型手术刀对B G进行对称性解剖，并分为亚左B G和亚右B G，称为L S B G和R S B G．

1．3海免亚口腔神经节全蛋白制备

    将L S B G和R S B G分别收集于0．5 m L的离心管中，置于4 c c冰浴中，加入3 0 0 I L L裂解液[8 m o L／L尿素、4 0 m m o l／L T r i s、2 m o l／L硫脲、质量分数为4％的C H A P S、1 0 m m o l／L D T F和1 m m o L／L E D T A(p H 7．4)]，采用超声破碎技术振荡破碎8～1 0 m i n，收集破碎液置于4℃冰箱中2 4 h以上，或确保海兔B G已最大量地释放细胞内含物．将B G内含物置于冷冻离心机内，以1 0 0 0 0 0 r／m i n速度超速离心2 0 m i n，去除离心液上层的大量脂类化合物，分离提取离心液中间层的透明澄清蛋白质样品，即为L S B G和R S B G的全蛋白提取液，供2 D—P A G E分离．L S B G和R S B G蛋白质含量测定按常规的考马斯亮蓝法分析，标准蛋白质选择纯度为9 9％的牛血清白蛋白．

1．4急性镉盐胁迫条件下海兔亚口腔神经节制备

    挑选4 0只体重为1 6 0～2 0 0 g的海兔，随机分成对照组和实验组，在无污染海水小池中饲养2 d．人工配置1 O g／m L的氯化镉作为污染源，构成镉盐胁迫环境且用于养殖海兔．养殖时间控制在2 4～2 6 h内，随后立即分离L S B G和R S B G，收集且置于一7 0℃冻存备用．按1．3节方法制备海兔亚口腔神经节全蛋白，海水中的氯化镉浓度用电感藕合等离子体质谱法进行监测和控制．

1．5口腔神经节组织切片与染色

    按常规组织切片技术制备海兔B G组织切片，然后进行脱蜡和苏木精染液染色，置于显微镜(4 0 0放大倍数)下观察和拍摄．

1．6双向凝胶电泳

    参考文献[3，9]的2 D—P A G E技术，优化分离海兔L S B G和R S B G全蛋白质，并用银染法进行蛋白质斑点染色．用图像扫描仪对已染色后的全蛋白质分离胶板进行透射扫描．全蛋白质斑点图谱用I n v e s t i g a t o r H T D a t a b a s e软件进行图像分析，筛选差异蛋白质．

1．7蛋白质的原位酶解与分析

    采用自制取样器，直接从分离胶上获取蛋白质斑点样品，并保存在0．5 m L离心管中，进行酶解．酶解和肽段提取的过程参照Z h u o等¨的方法进行．

1．8质谱分析

    将蛋白质酶解样品与H C C A基质(H C C A溶于4 0％乙腈，0．1％T F A溶液至过饱和)以1：1的体积比混合，取1 t x L混合液点滴在不锈钢M A L D I—T O F质谱点样板上，置于空气中自然风干后进行质谱分析．质谱分析条件：高分辨率反射模式，离子源加速电压1为2 0 k V，加速电压2为1 8．8 5 k V，质谱信号单次扫描累加1 0次，测定正离子谱．采用外标法(A P分子量2 9 6 1 0 0 0)标定多肽质谱峰峰位．

1．9数据库检索与蛋白质鉴定

    参考Z h u等和Z h o u等¨的方法进行蛋白质鉴定．在M A S C O T检索网站(h t t p：／／w w w．m a t r i xs c i e n c e．c o m)进行检索，利用S WI S S—P O R T，M S D B和N C B I等3个数据库对混合物肽段质量数据进行检索和蛋白质鉴定．

2结果与讨论

2．1海兔口腔神经节显微图

    图1(A)为N L C S口腔神经节的显微图谱．可以看出，B G具有对称的形态结构，根据图示的对称解剖线进一步分解为L S B G和R S B G．图1(B)为在镉盐胁迫下，N L C S口腔神经节的显微图．可以看出，海兔受镉盐胁迫后，L S B G中心区域含有相对较大面积的斑点聚合体，说明了L S B G组织受急性镉盐损伤后，造成斑点聚合体现象．从比较正常的B G显微形态图[图1(A)]可发现，图1(B)中的R S B G组织显微形态图与图1(A)中的R S B G极为相似，均未受到急性镉盐的创伤．为了证实这一实验现象，选用铅盐(1 0 p~g／m L)作为急性污染源，其污染N L C S时间长达2 4 h，所观察到的实验现象与图1极为相似．由此看来，海兔B G可进一步分为亚B G，其中L S B G和R S B G可能执行不同的生理功能；L S B G易受各类重金属污染物的侵袭，并造成器官组织受创伤现象，而R S B G却具有天然的抗重金属创伤的屏障，因此可认为R S B G和L S B G之间存在细胞结构上的差异性．

 

 

2．2 R S B G和L S B G之间的差异蛋白

    分别制备R S B G和L S B G全蛋白样品，其2 D—P A G E图谱如图2所示．经过I n v e s t i g a t o r H T D a t a b a s e软件统计图2(A)和(B)中均含有约3 0 0个蛋白质斑点，其中蛋白质斑点和亚基分子量的分布规律较为相似，说明在R S B G和L S B G之间的多数蛋白均是同类蛋白质，并同步执行着许多相似的生理功能．参考图2结果，并与前期有关N L C S的B G全蛋白的2 D—P A G E图谱相比可见，其蛋白质分布规律也存在着较高的相似性J．经统计分析发现，R S B G和L S B G之问存在着1 5个差异蛋白质斑点，其中L S B G

有9个差异点，R S B G有6个差异点．选用P M F技术分别对这l 5个蛋白质差异点进行逐一鉴定，获得9张较为理想的P M F谱图，鉴定成功率约为6 0％以上；部分蛋白质斑点匹配率不是很高，主要是一些糖蛋白、膜蛋白、假定蛋白和酶类．

 

 

 

2．3在镉盐胁迫下亚口腔神经节的差异蛋白质

    图1结果已显示，流动海水中的镉盐能够胁迫N L C S，并使亚B G组织发生病变，最后由急性重金属中毒而引发死亡(4 8～5 4 h)．针对这一实验现象，选用1 0 g／m L镉盐作为污染源，镉盐暴露时间为2 4 h．用蛋白质组学技术分离、筛选和鉴定在镉盐胁迫(暴露)前后，N L C S口腔亚神经节的差异蛋白质．图3为N L C S受镉盐胁迫(暴露)前后，其L S B G全蛋白质的2 D—P A G E图谱．经过I n v e s t i g a t o r H TD a t a b a s e软件统计，在图3(A)和(B)中均含有约3 0 0个的蛋白质斑点．虽然两图中所显示的斑点和蛋白质亚基分子量分布规律较为相似，但还是存在着一定的差异蛋白．这说明了N L C S受镉盐胁迫(暴露)前后，它的L S B G组织或细胞结构不仅受损，而且还表达了由镉盐诱导的应激(差异)蛋白质．

用蛋白质组分析软件对图3(A)和(B)进行分析发现，经镉盐诱导后，L S B G和L S B G共产生了2 5个差异蛋白质，其中包括9个下调蛋白和1 6个上调蛋白．采用P M F技术鉴定这些差异蛋白质，获得了1 9个鉴定结果，鉴定成功率为7 6从已检索的结果可获悉，L S B G 1 5蛋白斑点匹配率较高，检索分值为8 0，超过高匹配率7 6的分值限度，鉴定为硫氧还原蛋白质(T h i o r e d o x i n s)．将其它一些匹配率较高(6 0分值以上)的蛋白质鉴定为假定蛋白(H y p o t h e t i c a l p r o t e i n X C C 4 2 1 1，L S B G 8)、1，5一二磷酸核酮糖一羧化酶／加氧酶的亚基(R i b u l o s e一1，5-b i s p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e／o x y g e n a s e l a r g e s u b u n i t，L S B G 9)、类似K I A A 0 6 1 4蛋白(S i m i l a r t oK I A A 0 6 1 4 p r o t e i n，p a r t i a l，L S B G c d 1)、甲羧基四氢叶酸水解酶(F o r m y h e—t r a h y d r o f o l a t e h y d r o l a s e，L S B G c d 3)、未知蛋白(U n k n o w n p r o t e i n，L S B G c d 6)、含氮还原酶(A z o r e d u c l a s e，L S B G c d 8)等．这些蛋白质来源于L S B G和L S B G之间的差异蛋白质，推测均为镉盐诱导的结果，是N L C S在抗镉盐毒性过程中产生的应激蛋白质，显示出上调或下调现象，也可能存在研究N L C S中枢神经系统毒理学和监测流动海水中镉盐污染程度及危害性的蛋白标志物．为提高蛋白鉴定的可信度，对全球各大文献信息库与数据库进行检索和比对发现，在这1 9个差异蛋白质点中，已有2个蛋白质参与由镉盐诱导神经致毒途径的报道¨H J．采用L O C t r e e数据库对这2种差异蛋白质进行亚细胞定位，结果见表1．

 

    热休克蛋白(H s p)的主要生理功能是辅助蛋白质折叠、去折叠、维持细胞蛋白质结构稳定性及防止蛋白的变性．昆虫A e d e s a l b o p i c t u s C 6／3 6细胞系细胞对C d的吸收、防御机制及细胞启动防御机制主要表现为诱导热激蛋白表达¨，从而抵抗蛋白质变性或凝集．

    硫氧还蛋白质(T h i o r e d o x i n，T r x)与硫氧还蛋白还原酶(T h i o r e d o x i n r e d u c t a s e，T r x R)和N A D P H起构成硫氧还蛋白系统(T r X系统)，并在调节细胞内氧化还原平衡中发挥重要作用¨．T r x不仅可激活氧化还原酶的活性，而且可发挥活性氧(R O S)的清除剂作用．T r x通过巯基氧化还原调节N F K B…和丝裂原活化激酶(M A P K)的活性，并影响细胞内的分子通道．不同金属离子对H e l a细胞中TⅨ的氧化作用表明镉盐对I h的作用尤其明显；随着镉盐浓度的增加，TⅨ的氧化还原作用速率明显下降¨．

表明T r x对镉盐浓度呈正对应的关系，可认为N L C S的B G中T r x蛋白质表达量与流动海水中的镉盐污染程度存在对应关系，从而推测T r x蛋白质可作为监测流动海水镉盐污染程度的蛋白质标记物之一．

    图4为N L C S受镉盐胁迫(暴露)前后，R S B G[图4(A)]和R S B G c[图4(B)]全蛋白质的2 D—P A G E图谱．经过I n v e s t i g a t o r H T D a t a b a s e软件统计发现，图4(A)和(B)中含有约3 0 0个蛋白质斑点，其中斑点和蛋白质亚基分子量分布规律较为相似，但还是存在着一定量的差异蛋白．说明N L C S受镉盐胁迫(暴露)前后，其R S B G组织或细胞结构可能发生了轻微损伤，并表达了由镉盐诱导的应激(差异)蛋白质．

对图4进行剖析同样可以发现，N L C S经急性镉盐诱导前后，N L C S的R S B G共产生2 1个差异蛋白质，其中有8个下调蛋白，1 3个上调蛋白．采用P M F技术对2 1个差异蛋白质进行鉴定，共获得1 5张P M F谱图，差异蛋白质鉴定成功率为7 1．4％．

 

    从检索结果中可以获悉，差异蛋白R S B G 1的蛋白点匹配率较高，分值为1 0 2，超过高匹配率7 6的分值限度，鉴定为肌球蛋白(T r o p o m y o s i n)．其它一些匹配率较高(6 0分值以上)的蛋白质为尚未命名蛋白(U n n a m e d p r o t e i n p r o d u c t，R S B G 7)、类似K I A A 0 6 1 4蛋白(S i m i l a r t o K I A A 0 6 1 4 p r o t e i n，R S B G n I 6)、甲羧基四氢叶酸水解酶(F o r m y l t e t r a h y d r o f o l a t e h y d r o l a s e，R S B G(=f 1 3)、未知蛋白(U n k n o w n p r o t e i n，R S B—G c d 4)、含氮还原酶(A z o r e d u c t a s e，R S B G c d 1 1)、类似人血清白蛋白(S i m i l a r t o h u m a n a l b u m i n，R S B G(：d8)和P R O蛋白(P R O 2 6 1 9，R S B G 9)．在这1 5个差异蛋白质中，R S B G有些上调和下调蛋白与L S B G相同，其中有3个下调蛋白，即虾红素类型金属蛋白酶(A s t a c i n．t y p e m e t a l l o p r o t e a s e，L S B G 2，R S B G 2)、假定蛋白(H y p o t h e t i c a l p r o t e i n，L S B G 4，R S B G 4)、G T P结合蛋白(P r e d i c t e d G T P—b i n d i n g p r o t e i n，L S B G 5，R S B G 5)；而共同发生上调的蛋白有5个，其中为假定蛋白(H y p o t h e t i c a l p r o t e i n D D B 0 2 1 9 2 2 4，L S B G l

2，R S B G c d 2)、类似K I A A 0 6 1 4蛋白(S i m i l a r t o K I A A 0 6 1 4 p r o t e i n，L S B G c d 1，R S B G c d 6)、甲羧基四氢叶酸水解酶(F o r m y h e t r a h y d r o f o l a t e h y d r o t a s e，L S B G c d 3，R S B G c d 3)、未知蛋白(U n k n o w n p r o t e i n，L S B G c d 6，R S B G c d 4)和含氮还原酶(A z o r e d u c t a s e，L S B G c l 8，R S B G c l 1)，这些蛋白可能属于B G中结构特性相对稳定的功能蛋白质．为提高鉴定差异蛋白的可信度，对这1 5个差异蛋白进行文献检索比对发现，仅有肌球蛋白(T r o p o m y o s i n，R S B G 1)与钙结合蛋白(分子量为1 6 0 0 0的C a l c i u m—b i n d i n g p r o t e i n，R S B G 3)可作为镉盐致毒机理研究的蛋白指示物¨．把已鉴定的差异蛋白质经L O C t r e e软件归类后发现，这些蛋白质均属于细胞质蛋白质，说明了镉盐在R S B G组织细胞中也能产生毒害作用，其发生场所主要是细胞质．

本文结果表明，B G受镉盐污染后，海兔的R S B G和L S B G表现出差异蛋白质(例如：硫氧化还原蛋白、热休克蛋白、肌球蛋白以及钙结合蛋白)，从某种程度上解释了镉盐的神经致毒途径．将部分差异蛋白质用于环境污染监测，可拓展环境污染生物监测新技术领域中蛋白质标记物的应用；另外，重金属铜盐、镉盐和锌盐均能引起肝脏或肾脏中金属硫蛋白的高表达j，但这一现象尚未在海兔B G中发现．可见，蛋白质组学技术是筛选与鉴定中枢神经系统中重要蛋白质的有效手段之一[21-22]．