【摘要】目的‘探讨口腔念珠菌病患者口内念珠菌珠菌种的分布和体外药物敏感性。方法收集患者标本采用念珠菌显色培养基对其进行分离鉴定，采用N C C I S M 2 7一A 2微量稀释法测定念珠菌株对特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素四种抗真菌药物以及联合用药的体外药敏情况。结果试验组和对照组口腔念珠茵检出率分别为7 4．6 5％％和3 5．4 2％，其中白色念珠菌分别占6 2．2 6％和5 8．8 2％。特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素对口腔念珠菌的体外试验敏感性总有效率分别为5 7．8 9％、8 6．8 4％8 4．2 1％和1 0 0．0 0％。特比萘芬与氟康唑联用时，念珠茵对药物敏感性增高。结论口腔念珠菌病仍以白色念珠菌为主，治疗时应进行真菌常规菌种鉴定及药敏试验。对耐药菌株的治疗，联合用药也是重要方法。

   【关键词】念珠茵病，口腔，微生物敏感性试验；药物疗法，联合

    口腔念珠菌感染是一种条件致病性真菌，临床可以表现为无临床症状的健康带菌者或有临床体征的口腔念珠菌病…。近年来，随着艾滋病(A I D S)患者的不断增多，器官移植的普遍开展，各种抗肿瘤化疗药物、免疫抑制剂、类固醇药物和广谱抗生素的大量使用，口腔念珠菌感染发生率呈上升趋势。本文旨在探讨口腔念珠菌感染患者菌种的分布和常用抗真菌药物的药敏情况，指导临床用药。

1资料与方法

1．1   临床资料  选择2 0 0 8年1月—2 0 1 0年1 2月我科诊治的1 1 9例患者为研究对象，其中7 l例患者为口腔念珠菌病患者(试验组)，符合含漱液菌落数超过3 0 0 C F U／m l的诊断标准。其中男2 2例，女4 9例，年龄1 9～7 8岁，平均(5 9．4 3±2．3)岁。其余4 8例为对照组，均排除口腔黏膜病、严重牙周病或龋病、长期使用广谱抗生素、抗真菌药物、肾上腺皮质激素或其他免疫抑制剂者，其中男1 6例，女3 2例，年龄2 2～8 0岁，平均(6 1．4 2±3．1)岁。

1．2  主要试剂和仪器  C H R O M a g a r念珠菌显色培养基(成都培洋生物工程有限公司)，法国梅里埃沙堡氏葡萄糖琼脂培养基(S D A)，特比萘芬(山东齐鲁制药厂)，氟康唑(辉瑞制药厂)，伊曲康唑(四川倍特制药公司)，制霉菌素(S i g m a公司)，吐温8 0(国药集团化学试剂有限公司)，R P M I M e d i u m1 6 4 0(G i b c o)，M O P S(S i g m a)，标准菌株A T C C 6 2 5 8(中科院南京皮肤病研究所)，标准菌株A T C C 9 0 0 2 8(中国医科大学细菌室)，9 6孔培养板(浙江拱东医用塑料厂)，电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂)，超净工作台(苏州净化设备厂)。

1．3   试验方法用棉拭子涂擦采集法 ，在病损处用蘸有0．9％氯化钠溶液的无菌棉签直接采集标本，在显微镜下观察到孢子和菌丝后，将标本直接接种于S D A上，培养4 8 h。随后将菌种转种于念珠菌显色培养基上，培养4 8 h后观察结果。取念珠菌菌种在S D A上3 7℃培养2 4 h，活化2次，使之处于指数生长期后期。挑取直径>1 m m的菌落溶于5 m l 0．9％氯化钠溶液制成混悬液，用血细胞计数板调节浓度至l x 1 0。～5x 1 0。C F U／m l。经R P M I 1 6 4 0液体培养基稀释1 0 0 0倍至1 x1 0一5 x1 0 C F U／ml。

    采用美国国家临床实验标准化委员会推荐的M 2 7一A方案进行微量液体稀释法进行体外药敏试验，氟康唑用双蒸水溶解，制成质量浓度为1 2 8 0 m l的贮存液，特比萘芬、伊曲康唑、制霉菌素用二甲基亚砜溶液溶解，制成浓度分别为1 2 8 0 0 g／m l、1 6 0 0 m l和1 6 0 0 g／m l的贮存液，置一2 0℃贮存备用。实验时取药物贮存液室温下融化，用R P M I 1 6 4 0液体培养基稀释，单用药敏试验时使特比萘芬、氟康唑终质量浓度为0．5 0～2 5 6．0 0 g／m l，伊曲康唑、制霉菌素为0．0 3～1 6．0 0 g／m l，联合药敏试验时，使特比萘芬、氟康唑起始质量浓度为6 4 m l，再倍比稀释，终质量浓度为0．5 0～6 4．O Oml。

药敏反应板的制备：单用药敏反应板：倍比稀释的药液按照由高到低的浓度顺序依次加入到9 6孔细胞培养板中，每行第1～1 0孔加药液1 0 0 l，第1 1孔加入1 0 0 l R P M I 1 6 4 0培养液，作为阳性对照孔；第1 2孔加入2 0 0 p,1 R P M I 1 6 4 0培养液，作为阴性空白对照孔。联合药敏反应板：采用棋盘滴定法将不同质量浓度的两种联用的药物各5 0 1加入9 6孔细胞培养板第1～8孔中，第9孔加入1 0 0 I x 1 R P M I 1 6 4 0培养液作为阳性对照孔，第1 0~L)J 1人2 0 0 I x l R P M I 1 6 4 0培养液作为阴性空白对照孔。两次均制备质控菌药敏板，将制成药敏板密封后置一2 0℃冰箱贮存。实验前将所需药敏板于4℃环境和常温下按顺序各放置2 h，然后在各行第1～1 1孔加入菌悬液各1 0 0 l。

将制备好的培养板放人3 7℃电热恒温培养箱中湿盒孵4 8 h，以A T C C 6 2 5 8和A T C C 9 0 0 2 8标准株作为实验质控菌株，培养4 8 h后，与生长阳性对照孔及阴性空白对照孔进行比较，用视觉法判定终点。

1．4  评价标准视觉法判定标准 ：根据菌鉴定培养基上不同颜色的菌落判断念珠菌菌种。白色念珠菌菌落颜色为绿色或翠绿色；热带念珠菌菌落颜色为蓝灰色或铁蓝色；光滑念珠菌菌落颜色为紫色；其他念珠菌菌落为白色。

    制霉菌素和特比萘芬的最低抑菌浓度(M I C)为培养基清亮、生长完全抑制所对应的最低药物浓度；氟康唑和伊曲康唑的M I C值为>18 0％生长抑制(与生长对照孔比较)所对应的最低药物浓度。M I C值在M 2 7一A 2规定的范围，认为有效。敏感性判定标准根据相关文献标准参考制定(见表1)，有效率为剂量依赖菌株数与敏感菌株数所占百分比。联合用药效果评价标准采用部分抑菌浓度指数(F I C值)比较，即联合用药时各药的M I C值分别除以各药的M I C值的商之和。F I C≤0．5，两药有协同效应；F I C>0．5且≤1．0，两药有相同作用；F I C>1．0且≤2．0，两药无关；F I C>2．0，两药有拮抗效应。

1．5统计学方法采用S P S S 1 1．5软件包进行统计学分析，试验组和对照组念珠菌检出率的比较采用x。检验，计量资料的组间比较采用检验，以P<0．0 5为差异有统计学意义。

2结果

2．1菌种鉴定情况1 1 9份临床送检标本共检出假丝酵母菌7 0株，总检出率为5 8．8 2％。其中试验组有5 3例检出假丝酵母菌，检出率为7 4．6 5％；对照组有1 7例，检出率为

3 5．4 2％；试验组明显高于对照组()(2=5．0 3，P<0．0 5)。在检出的各种念珠菌中，白色念珠菌4 3株(6 1．4 3％)，热带念珠菌1 O株(1 4．2 9％)，光滑念珠菌6株(8．5 7％)，其他念珠菌4株(5．7 1％)；混合菌株7株(1 0．0 o％)，两组患者的带菌情况和致病菌种的分布情况见表2。

2．2药敏结果氟康唑对A T C C 6 2 5 8的M I C值为1 6～6 4 g／I n l，对A T C C 9 0 0 2 8的M I C值为0．2 5～1．0 g／m l，此结果在N C C L S M 2 7一A 2的M I C值范围。特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素4种药物对口腔念珠菌的药敏结果如下：5株菌株对氟康唑不敏感(1 3．1 6％)、6株菌株对伊曲康唑不敏感(1 5．7 9％)、1 6株菌株对特比萘芬不敏感(4 2．1 1％)、制霉菌素全部敏感(见表3)。在氟康哇与特比萘芬联合用药4 0株中，协同作用有1 4株(占3 5．0％)，相加作用有1 9株(占4 7．5％)，无关作用7株(占1 7．5％)，未发现拮抗作用。联合用药对不敏感性念珠菌的药敏结果显示，特比萘芬与氟康唑联用，1 6株对特比萘芬不敏感株中有7株M I C值降至敏感范围，5株对氟康唑不敏感株中有3株降为敏感株。联合用药后，氟康唑、特比萘芬M I C范围较单独应用时明显降低，差异有统计学意义(t=3．1 9 6，3．6 0 2，P<0．0 5，见表4)。

3讨论

    念珠菌是人体的一种共生菌，一般条件下在口腔、胃肠道等处生长，属于正常菌群。但当机体菌群失调，免疫功能下降或免疫丧失，其可发展成为条件致病菌，导致严重的念珠菌病，或使原发疾病恶化、加重，甚至出现个体死亡。白色念珠菌是真菌感染中最常见的致病菌，占5 3％～6 8％。近年来，热带念珠菌、光滑念珠菌等非白色念珠菌已引起重视，R d e d i—n g等研究表明，非白色念珠菌在口腔念珠菌病中的治病作用越来越明显，本研究表明在口腔念珠菌病患者中，白念珠菌感染占6 1．4 3％。热带念珠菌为非白色念珠菌中毒力最强的菌种，占1 4．2 9％，与国内其他研究相近。本研究结果还发现，6 5％的致病非白色念珠菌未与白色念珠菌混合感染，这与念珠菌1 0 0％与白色念珠菌发生混合感染的报道不同。提示非白色念珠菌感染致病力增强，应弓l起临床重视。

    制霉菌素也是临床上较普遍的抗真菌药，其通过与菌膜上的固醇部分结合并改变其通透性，破坏菌体而达到治疗作用，目前作为局部外用治疗口腔念珠菌病的首选药物。本研究中制霉菌素M I C值比较稳定，均为8 m l，没有不敏感菌珠。特比奈芬是一种丙胺类的抗真菌药物，但目前报道结果显示特比萘芬对白色念珠菌的作用有较大的差异，特比萘芬对浅部白色念珠菌感染的治愈率为5 6％～7 0％[1 i。能否用于治疗白色念珠菌感染目前还没有统一观点，本研究中特比萘芬体外抗口腔念珠菌病菌珠总有效率为5 7．8 9％。本研究提示氟康唑与伊曲康唑问存在交叉不敏感或耐药现象。有报道显示两者存在交叉耐药性，因二者都是三唑类药物，在作用机制上存在交叉耐药的基础。

    本文通过研究特比萘芬、氟康唑、伊曲康唑、制霉菌素对口腔念珠菌的敏感性，为合理用药、减少毒副作用而达到提高口腔念珠菌病的治愈率，减少不敏感念珠菌株的产生提供了依据。

    研究发现唑类药物与特比萘芬联合应用能产生协同效应”，增强药物敏感性。唑类药物抗真菌机制是使真菌膜中麦角固醇的细胞色素P 4 5 0抑制失去酶活性，导致1 4 c t一甲基固醇的积聚及麦角固醇的缺失，而抑制真菌生长。特比萘芬的作用机制为通过高度选择性抑制真菌角鲨烯环氧化酶，从而使细胞膜形成受到阻碍而抑制细菌生长，二者作用于真菌生物合成不同靶位，产生协同效应，联合用药能阻止或延迟真菌对药物的耐药性，减少药物的毒副作用。本研究发现特比萘芬与氟康唑联合应用后的M I C值均较其单独应用数值均显著降低，两者均有菌株由单独应用的不敏感降为敏感，说明特比萘芬与氟康唑联合用药能够阻止或延迟白色念珠菌不敏感性菌株的产生，联合用药对耐药菌株的治疗有重要作用。

    总之，本研究发现口腔念珠菌感染患者以白色念珠菌为主，抗真菌药物选择应该遵从实验室药敏实验与临床用药相结合的原则，选择药物时注意唑类药物存在交叉耐药现象，避免减少盲目用药，特比萘芬与氟康唑联合应用可作为耐药菌株治疗重要手段之一。