合成生物学在医药及能源领域的应用

摘要：合成生物学是以T程学思想为指导，对天然生物系统进行重新设计与改造。同时设计并合成新的生物元件、模块和系统的崭新学科。合成生物学是自然科学发展到现阶段的产物，并已经在医药、能源等领域取得了一些显著成果。本文综述了在工程细胞中利用合成生物学方法构建抗疟疾药物青蒿索的前体物青蒿二烯，抗癌药物紫杉醇的前体物紫杉二烯，以及脂肪酸酯、脂肪醇、高级醇的合成途径等研究进展。此外，一些重要的合成生物学相关技术，大大加速工程细胞的重构与进化，为构建应用于生产领域的新功能细胞提供方便实用的工具。

关键词：合成生物学；基因模块；医药；能源；合成生物技术

引 言

   近年来，合成生物学由方兴未艾逐步走向飞速发展阶段，渐渐形成了特点鲜明的研究内容和应用领域。其研究内容主要包括：(1)新的生物零件(part)、组件(device)和系统(system)的设计与构建；(2)对现有的、天然的生物系统进行重新设计(http：／／syntheticbiology．org／)。2009年美国国家科学院医学院组织了12支由各界人士参加的“交叉学科究(IDR)”小组，讨论合成生物学的发展方向和多学科交叉性。认为合成生物学是生物学家、工程学家、物理学家、计算机学家等共同参与的多学科交叉领域，可通过重构生物应用于药物、公众健康、环境、可再生能源等方面。

合成生物学是工程学与生物科学发展到现阶段的产物。人类基因组及多种模式生物基因组测序的实现，以及大量的“后基因组”工作，使积累的生物学数据达到了天文级。然而，现有的信息发掘方法仍局限于对生命现象的逐层深入描述，难以隔离研究并深刻解析生命的内在运行模式。合成生物学正是在这种背景下产生的，通过“由下至上(bottom—up)”地构建生命活动，以其独特的合成视角解读生命，为理性设计和改造生命提供了可能。近年来，基因测序与合成逐步实现高保真、低成本。基因测序与合成公司已在世界范围内广泛成立，提供优质、廉价的服务。先进的基因测序与合成技术使得合成生物学设计新生命密码和构建功能细胞更加容易。

更重要的是，人类健康、能源、环境等领域的重大需求也牵引着合成乍物学的迅猛发展。将基因元件(启动子、转录调控区域、核糖体结合位点、开放阅读框、终止子等)依据工程化日标需要，有机重构和连接起来，便形成了功能基因模块。通过对已有生物网络加以利用，同时引入新的功能基因模块，表达出天然细胞不能合成的新产物，在合成药物、合成生物能源等方面已有突出进展。主要代表人物有美国加州大学伯克利分校化工系的JayKeasling、麻省理工学院化工系的Gregory Stepha—nopoulos以及加州大学洛杉矶分校化工系的JamesLiao，分别在涉及医药和能源的青蒿素、紫杉醇，生物柴油、高级醇的生产方面有杰出的工作。

1合成生物学应用于医药领域

1．1青蒿二烯的生物合成

    Jay Keasling在工程细胞中生产抗疟药物青蒿素的前体物青蒿二烯的研究工作堪称典范。在获得青蒿二烯合成途径的关键新基因信息后，Keasling小组于2003年在大肠杆菌中成功构建了崭新的青蒿二烯合成路径u]。这条合成路径分为两个模块。第一个模块是以酰辅酶A为出发分子，经由甲羟戊酸来合成异戊二烯焦磷酸(IPP)。这就避开了大肠杆菌原有的以3一磷酸甘油醛(G3P)和丙酮酸为前体物合成IPP的DXP途径，使得细胞代谢流经由新途径高效产生IPP分子，为下游合成路径提供充足的底物分子。第二个模块则从Cs的IPP出发，经由异戊二烯链延长途径生成C，。的法尼基焦磷酸(FPP)，最终在ADS酶的作用下合成青蒿二烯，最高产量达122 mg·L～。上下游模块均来自真核生物中的代谢途径，将其密码子优化并重构于原核生物大肠杆菌中，并成功合成目标产物，开创了生物合成的崭新道路(图1)。

2006年，Keasling小组又以酵母菌为宿主，通过对内源的乙酰辅酶A到FPP途径的关键基因进行上调或下调，同时引入基因优化过的外源模块，成功实现了产物青蒿二烯产量的稳步提高瞳]。对内源基因上调的方式有两种，其一是增加基因拷贝数，如tHMGR酶的基因，其二是通过转录因子来上调基因表达量，如ERG系列的基因。对内源基因的下调则是采用基因敲除的方法。通过对合成路径涉及基因的一系列微调，使产量达到153mg·L～是以往报道的二烯类分子产量的500倍。

在此基础上，研究小组又设计了人工蛋白支架(synthetic protein scaffolds)，对大肠杆菌内已构建的上游模块：从乙酰辅酶A到甲羟戊酸的合成途径进行了优化。三个反应酶AtoB，HMGS，tHMGR通过蛋白支架以不同分子数比例捆绑在一起发挥作用，解决了中间代谢物积累造成的合成效率降低以及对宿主的毒副作用问题[3]。具体机理是将高等动物细胞中的配体受体作用关系引入到大肠杆菌中，将配体分子的基因序列与模块中的反应酶基因融合表达，从而将受体分子以不同分子数连成一串，构成柔性支架。由于脚手架内各个受体分子

间由一定长度的多肽连接，就避免了因多个配体受体结合造成的空间位阻问题。在反复实验与调试后，研究小组发现三个酶分子以1：2：2的比例连在一起作用效果最强，产量达初始值的77倍，约5 mmol·I。一1(740 mg·L一1)。

    随着后期工业化发酵，研究小组又发现来自酵母的外源基因HMGS和tHMGR表达的酶不足以平衡外源代谢流，成为瓶颈反应。他们以金黄葡萄菌中的相关酶基因进行替换后，青蒿二烯产量立刻

增加一倍。通过与工业发酵过程优化的结合，作为工业产品的青蒿二烯最终产量高达27．4g·L一1[“。

    合成生物学成功用于重要药物的合成，引起了广泛关注。由于在生物合成抗疟疾药物方面的突出成就，Keasling被美国《发现》杂志评选为2006年度最有影响的科学家。Keasling小组在酵母菌中的研究成果被评为当年“世界十大科技进展”之一。

1．2紫杉二烯的生物合成

     Gregory Stephanopoulos的研究小组于2010年在大肠杆菌中成功实现了抗癌药紫杉醇的前体物紫杉二烯的生物合成“]。这是基于他们对萜类物质代谢途径以及大肠杆菌细胞微调的长期研究而取得的成果。研究小组将内源的IPP合成途径定义为上游模块，将后续合成紫杉二烯的途径定义为下游模块，其工作也主要集中在如何对上下游模块进行微调。其原因在于：如果只单一提高上游遥量而不顾下游，势必造成中间代谢物积累和浪费，且产生中间抑制物吲哚；而若下游通量过高则多数酶分子不能参与合成反应，加重细胞表达负担。

    研究小组采用改变质粒拷贝数和启动子强度的方法对上下游通量的比例进行了微调。通过对已有文献的整合以及自己的测试工作，研究小组确定了三种质粒pSCl01，p15A，pBR322的拷贝数分别urNorphadicnc为5，10，20，而整合入基因组中的基因拷贝数相当于1。三种启动子Trc，T5，T7的相对强度分别为1，2，5。通过这几种质粒和启动子的组合，使上下游模块的通量比例发生变化，再检铡含有不同通量比例的细胞内的产物产量。在此过程中，模块内部基因是单顺反子还是多顺反子表达形式也影响产量变化，即多个基因是在一个启动子后表达还是在各自的启动子后表达。经过一系列微调与组合后，具有最优性状的菌株目标产物的产量高达(1020=i：80)mg·L～，实现了对碳代谢流的高效利用和协调。同时，通过蛋白质工程的手段对细胞色素P450氧化还原酶进行改造，在工程菌中首次成功异源表达。

1．3其他方面的应用

   除应用于药物合成外，合成生物学在医药领域还有其他尝试。在疾病机理研究方面，Rolli等在果蝇细胞中构建了哺乳动物B细胞抗原受体信号处理过程，研究发现了其信号响应的“正反馈”机理oj。在药物靶点确认方面，Kohanski等将人工构建的RNA调控线路与分子生物学手段结合起来。确定了三大类不同靶点抗生素对细菌具有共同的致死反应过程”]。在药物筛选方面，Weber等在胚肾细胞中引入了能使抗结核药物乙硫异烟胺(ETH)正常发挥药效的辅助小分子的人工筛选系统[8]。在构建治病微生物方面，Lu等和Anderson等分别构建了人工噬菌体和定向入侵癌细胞的大肠杆菌[9。¨。未来，合成生物学在医药领域必将有更多尝试，也将取得更多新成果。

2合成生物学应用于能源领域

2．1高级醇的生物合成

James I．iao小组2008年将外源代谢途径中生成酮酸及醇的反应酶基因引入到大肠杆菌中，通过对基因优化和重构，实现了微氧发酵条件下大肠杆菌内全新的高级醇合成路径[1 2。。具体做法是先以糖酵解过程中的产物(如丙酮酸等)为前体物，在外源酶的作用下进入各条人工构建的氨基酸合成途径。在生成相应的酮酸中间物后，即被酮酸脱羧酶和醛脱氰酶催化反应，先后生成醛和醇，从而合成一系列具有生物能源意义的高级醇类。在这个设计中，可将外源基因分为两个模块：链延长反应模块和生成醇反应模块。其中，生成醇反应模块对于每一种酮酸反应物都是一样的，均由酮酸脱羧酶(KDC)和醛脱氢酶(ADH)基因构成。而链延长模块则有所不同，不同的酮酸产物需要不同的外源酶系，由不同的外源基因簇表达。

 在构建过程中，为了避免不必要的碳代谢支路造成的资源浪费，研究小组先后将大肠杆菌内源的琥珀酸、脂肪酸、乙酸、乙醇、乳酸等代谢路径的关键酶基因敲除[1 2。。虽然这些路径的切断并不会在微氧条件下集中更多代谢流(因为代谢流大部分流向TCA循环)，但实验表明这些代谢流的截断还是有利于目标产物产量提高，这也说明理性更改代谢流向也是重要而有效的细胞藿构手段。之所以选择微氧环境，是因为若厌氧发酵极可能造成细胞氧化还原不平衡(如NADP+／NADPH失衡)，且高级醇合成偏向于细胞稳定期进行，因此选择让细胞快速牛长起来的微氧发酵更为有利[1 3|。

高级醇合成途径开辟了前所未有的生物能源合成模式，具有很强的合成生物学借鉴意义。在之后几年中，Liao小组继续对链延长模块中关键酶进行蛋白质工程的改造，逐渐蕈构出合成C。～Cs醇类的反应酶，并将链延长反应分类为IPMS(2-异丙基苹果酸合酶)途径和AHAS(乙酰羟酸合酶)途径。这些工作使得高级醇合成途径变成了能够控制产物分子结构、控制链长的生产平台，为后续开发其他功能产物提供了基础，也为合成生物学应用于其他生产领域提供了思路(图2)c”]。此外，Liao的研究小组在光自养型蓝细菌合成高级醇方面的工作也处于世界领先地位。2009年，他们在蓝PCC7942中构建了由丙酮酸到异丁醛的合成途径，利用的就是AHAS链延长模块和酮酸脱羧酶u“。合成的异丁醛具有平台代谢物的意义，可以生成一系列具有重要功能的生物分子。由于蓝细菌质粒的容量较低，外源模块的基因是通过同源晕组整合人基因组中来表达产物的。蓝细菌是光自养型原核生物，既具有类似于高等植物的对生长底物的低需求，从而降低生产成本，又具有类似于大肠杆菌的相对清楚的遗传背景，有利于进行基因改造。同年，Liao因其在“循环利用二氧化碳合成高级醇”方面的杰出工作获得了美国环保署颁发的“总统绿色化学挑战奖”。

2．2生物柴油的合成

    Jay Keasling在生产脂肪酸(即生物柴油)衍生物类生物能源方面有着卓越工作u引。其研究小组在2010年成功地在大肠杆菌中实现了多功能模块集成，使得大肠杆菌同时具有了合成脂肪酸酯、合成脂肪醇、利用五碳糖为底物的多种功能[1引。首先，以糖酵解生成的乙酰辅酶A为底物，通过引入外源硫酯酶(TES)，将原有内源脂肪酸链延长途径切断，生成不同长度的自由脂肪酸。然后，脂肪酸在酰基辅酶A连接酶(ACI，)的作用下合成脂酰辅酶A，fade基因的敲除避免了其进入降解路径。之后在脂肪酰辅酶A还原酶(FAR)的作用下生成脂肪醇。若与外源的乙醇生产模块结合起来，便可合成脂肪酸酯，即生物柴油。在成功打通合成代谢路径后，Keasling小组对硫酯酶进行了进一步研究，发现引入不同生物来源的硫酯酶基因，生成的生物柴油和脂肪醇链长组成也发生很大变化，这与前人的研究发现也是基本吻

合的。经研究，已经可以生成以C，。和C。。为主的生物柴油和以C。z或Ct。为主的脂肪醇。控制链长有利于合成高纯度产物，在实际能源生产中十分有助于降低成本。在此基础上，研究小组又将半纤维素代谢模块引入到这株菌中，半纤维素底物通过木聚糖酶(由xynlOB和xsa基因表达)的作用生成木糖，直接进入细胞碳代谢网络。让工程化细胞利用五碳糖生产产物，非常有利于降低生产成本。Keasling将多种新功能集于工程化细胞一身的研究思路对其他方

面的合成生物学研究也有借鉴意义。

    近年来，LS9公司在合成生物学生产能源领域方面有着显著成果。其尝试使用“一步发酵法”利用工程细胞生产可再生能源甚至直接生产石油(http：／／www．Is9．corn／)。最近，LS9支持下的研究小组在蓝细菌中发现了两个重要的酶：脂酰ACP还原酶和醛脱羰酶[17J。这两个酶可以利用原核生物脂肪酸合成途径的中间代谢物脂酰ACP为底物，生成烷烃类和烯烃类。特定链长的烃类是高级燃料如航宅燃料的主要成分，因此合成烃类的生物酶基因可以被合成生物学所利用，进行新型的生物能源生产。

3合成生物学相关技术的发展

    近年，一些先进生物技术的发展为合成生物学提供了大尺度改造细胞、高效生产全新生物产品的技术支持。这些技术包括基因组水平的DNA合成技术、多元自动化重组技术(MAGE)以及微流体技术等。2010年，Venter小组实现了蕈状支原体基因组的全化学合成，并成功将其导入山羊支原体细胞中表达新的遗传物质，获得了全新的人工细胞。这是一次巨大的技术进步，为合成生物学提供了细胞水平的基因合成技术支持[】引。Church等开发的多元自动化重组方法(MAGE)，向大肠杆菌底盘细胞中导入大量DNA重组片段，对内源、外源代谢途径中所涉及的关键基因同时进行微调，对副产物支路进行一次性失活，同时辅以高通量筛选，极大地缩短了合成生物网络的优化时间[1 91。分子生物学的多数液相反应(DNA合成、凝胶电泳、分子杂交等)集成到生物芯片上已成为重要趋势，这就需要强大的微流体控制装置。此外，微流体技术可以严格控制输入细胞的分子，细化研究过程∞叩；并将不同性状细胞在个体水平上区分开，方便筛选工作。

     合成生物学的发展也遇到一些技术瓶颈，有待取得突破性成果。自现代生物技术诞生以来，DNA化学合成技术不断进步，合成DNA的长度在增加，成本也逐渐降低，例如GENEART公司提供每对碱基0．39美元的廉价合成服务，但仍然不能高效、高保真、低成本地合成DNA大片段乃至基因组Venter小组的合成基因组研究项目，投入200人／年，耗资4000万美元[21。。因此低成本、快速、准确地化学合成大片段DNA甚至基因组是实现合成生命的关键技术问题。

合成生物学也有其学科基础性问题。虽然已经解析了1000余种微生物的基因组，但对基因功能的解析不够透彻。即使最常研究的大肠杆菌、酵母等模式微生物，仍然至少有20％以上基因功能未知。正是由于生物系统的复杂性、系统噪声和随机性，使得合成的基因线路不一定按照预期设计发挥功能，元件与宿主的不相容性将造成不可预测结果[z引。在利用合成生物学改造生命以实现新功能及合成新产品的过程中，研究者将始终面对这些难题，尝试突破这些瓶颈，以使合成细胞网络具备清晰化、可控、协调、稳定、高效等特点。

4 展望

    合成生物学以工程学思想为指导，对现有的、天然存在的生物系统重新设计和改造，同时也致力于设计合成崭新的生物元件、模块和系统。尤其在应用方面，合成生物学构建的人工生物系统可以在合成重要生物制品、生产清洁能源、维护人类健康等方面有重要的发展空间。目前合成生物学的研究成果集中于医药和能源领域，未来其他领域也将有令人瞩目的破性成果。总之，合成生物学具有广泛的应用前景和强有力的技术支撑，已成为当今化

工领域中一个重要的前沿研究方向。